Биосинтез на ДНК. Репликация

Биосинтез на ДНК
Репликация

ДНК матрица;
Четирите
дезоксирибонуклеотидтрифосфати –
АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ;
Белтъци (SSB, RP-A);
Няколко семейства ензими- ДНК
полимерази (DNApol I, II и III при
прокариоти; ,,,, при еукариоти),
праймази, хеликази, лигази и
топоизомерази

Участниците в процеса репликация са:
Репликация – биосинтез на две
идентични ДНК молекули;

(a) Hypothesis 1:
Semi-conservative
replication
(b) Hypothesis 2:
Conservative replication
Intermediate molecule
(c) Hypothesis 3:
Dispersive replication
Принципни модели на репликация

Репликацията се извършва по полуконсервативен механизъм,
доказан от Meselson & Stahl, 1958.

Репликацията при E. coliзапочва от дълги палиндроми,
означавани като “ori С” или начала, които не са консервативни
Множество субединици на инициаторния протеин- DnaA се
свързват към 9 нуклеотидните повтори в региона на “ori С”.


Инициация:
GATC общ мотив
за ori C
AT bp улеснявят
разплитането на
спиралата

Процеса репликация
протича в три етапа:

Участъкът, които се реплицира от едно начало - репликон.
Към “ori” се свързва белтък-инициатор на репликацията, а до
него трябва да се свърже белтък-натоварващ фактор. Той
регулира свързването с хеликазата. При E. coli – това са DnaА и
DnaC, при еукариоти- различни Cdc, контролиращ прехода от G1
към S фазата.
Разделянето на двете полинуклеотидни вериги се осъществява от
ензими - репликативни хеликази, които представляват белтъчни
комплекси и разрушават водородните връзки между
комплементарните азотни бази.
От началната точка разплитането върви двупосочно от две
хеликази. Образува се репликативна вилка.
Инициация:

Инициация

Структура на
DNAP I from E. coli
пръсти
длан
палец 5’-3’ полимеразна активност
3’-5’ екзонуклеазна и
5’-3’ екзонуклеазна
активности

Към едноверижната ДНК в
репликативната вилка се
присъединяват белтъци,
свързващи едноверижна ДНК
(при прокариоти-SSB и при
еукариоти, RP-A).
Към хеликазата върху
матричната ДНК се
присъединява ензима
“праймаза”- тя изгражда т.нар.
праймери (зародиши) de novo.
Праймазата не се нуждае от 3’-
ОН край за да започне синтеза
на нова верига, за разлика от
ДНК полимеразите.
 Праймазата свързва
както рибо- така и
дезоксирибонуклеотиди.

След като се синтезира праймера, към него се свързва
основният ензим, изграждащ новата ДНК верига – ДНК
полимераза. Съществуват няколко типа ДНК полимерази:
ДНК полимераза І- има
екзонуклеазна активност и
отстранява праймерите.
Има отношение и към
репарацията на ДНК;
ДНК полимераза ІІ- участва
в индукцията на SOS -
репарация;
ДНК полимераза ІІІ
/репликаза/ - отговорен е за
елонгацията на
репликацията.
ДНК полимераза  -Еукариотната
праймаза, изгражда праймерите;
ДНК полимераза - има основно
редакторска активност и участва в
репарацията;
ДНК полимераза - реплицира
митохондриалната ДНК верига;
ДНК полимераза - изграждаща
водещата верига;
ДНК полимераза - изграждаща
закъсняващата полинуклеотидна
верига.
ПРОКАРИОТИ: ЕУКАРИОТИ:

Елонгация:
Изграждането на новата
ДНК верига винаги става
в посока 5’3’;
Водещата верига се
реплицира по
непрекъснат механизъм,
осъществява се от ДНК
полимераза ;
Закъсняващата верига се
изгражда на малки
фрагменти, нар.
Фрагменти на Оказаки от
ДНК полимераза .
Плъзгащата се скоба
запазва DNApol здраво
свързана с ДНК
Реплизома: 1000 нд/c

Праймерите се синтезират от
праймазата, като за водещата
верига той е само един.
Към 3’-ОН края на праймера се
захваща ДНК пол ІІІ и се
присъединяват нуклеотидите.
Изграждат се фрагменти на
Оказаки при закъсняващата
верига.
ДНКпол І,чрез 5’3’
екзонуклеазната си активност
разгражда праймерите на
закъсняващата верига и чрез
3’ 5’ полимеразната
активност изгражда веригата.
Лигазите съшиват фрагментите
на Оказаки.

cartoon

Разплитането на двойноверижната молекула ДНК създава
свръхспирализация в крайщата на репликативната вилка. За
освобождаване на напрежението се включват ензимите
топоизомерази. Те биват два вида:
Топоизомераза І-
осъществява
едноверижно
разкъсване на ДНК и
действието и не изисква
допълнителна енергия
от АТФ.

Топоизомераза II осъществява разкъсване и в двете
ДНК вериги и се нуждае от енергията на АТФ. Този
вид топоизомерази имат основно значение при
разделянето на пръстенните дъщерни молекули
(катенани), които се получават при репликация на
кръгова ДНК.
Топоизомераза ІІ

Терминация:
Един път стартирала, репликацията продължава докато обхване
цялата молекула ДНК.
Всяка една дъщерна, новополучена верига съдържа по един
праймер на 5’ края си, който ако не се отстрани и замени ще
доведе до скъсяване на ДНК. Проблемът на “краищата” се
решава от ензима- теломераза.
Теломеразата е РНК-белтъчен комплекс.
Той синтезира тандемно повторената единичната теломерна
последователност, при човека тя е (ТТАGGG)n, като за матрица
използва молекулата РНК в комплекса.

Репликазната активност на Pol зависи от 36 кD белтък,
означен като PCNA (proliferating cell nuclear antigen 20p12 )-
ядрен антиген на делящите се клетки (20p12 хромозомен
локус). Антитела срещу този антиген се използуват при
имунохистохимична диагностика на различни видове
тумори.
Нарушения в репликативните механизми водят до
заболявания. Приложение в диагностиката.
Със
Anti-PCNA
Без
Anti-
PCNA

Синдрома на Вернер
(синдром на преждевременното стареене).
При болните от синдрома на Вернер се развиват ранни белези на
стареене. След 20г. възраст косата бързо побелява, а кожата
се отпуска и сбръчква, често развиват катаракта и други
старчески изменения- деформация на костите, атеросклероза,
диабет. Рядко достигат до 50г. възраст.
Здрав човек
и болен от
синдрома на
Вернер на
36г. възраст
Пациент с
синдрома на
Вернер на
50г. възраст

Общият вид на реплициращата се ДНК се определя от
взаимодействието между матрицата и репликационната вилка.
Основните модели на репликация са тип “око”, тип “търкалящо
се колело “ и тип “D-бримка”.
ОСНОВНИ ТИПОВЕ НА РЕПЛИКАЦИЯ
Репликация тип “око”
Характерен е за линейни и
кръгови молекули ДНК.
При репликация на кръгови
молекули ДНК се означава
като тип ”q” или Q
репликация.
Получават се две пръстенни
молекули ДНК вплетени една
в друга (катенани)

Типична е за малки пръстенни ДНК молекули (основно при фаги
и вируси).
Определена ендонуклеаза разкъсва фосфодиестерната връзка в
едната верига на ДНК. Към орбазувалият се свободен 3’ край се
присъединява ДНК полимеразата и репликацията започва по
матричната, неразкъсана ДНК верига.
Удължаващият се 5’ край се избутва извън кръга, като нишка на
кълбо. Комплементарната верига се изгражда върху 5’
удължаващият се край чрез фрагменти на Оказаки като
закъсняваща верига.
Репликация тип търкалящо се колело

Репликация тип D-бримка
Типична форма за репликация на митохондриалната ДНК в
животински клетки.
Има две различни “ori” места за двете вериги ДНК- тежка и лека.
Първоначално започва синтеза на тежката верига върху матрица
леката верига.
Новосинтезираната тежка верига избутва матричната тежка
верига. Получава се структура подобна на буквата D. На около
2/3 от кръга се освобождава началото за леката верига и започва
нейния синтез по матрица тежка верига.
Двете нови вериги се изграждат по непрекъснат начин, без
фрагменти на Оказаки.

Установено е, че ДНК пол ІІІ при E.coli внася една грешна
база на всеки 10
4
базови двойки in vitro.
Честотата на грешки при рeпликацията на еукариоти е 1 грешка
на 10
9
базови двойки. Тази повишена точност се дължи на
редакторските свойства на отговорните за репликацията ДНК
полимерази, които осигуряват точност от 1 на 10
6
както и на
репариращата система –mismach repair чрез която се достига
10
9

ДНК полимераза І
ДНК полимераза І І І
Прокариоти: Еукариоти:
ДНК полимераза 
ДНК полимераза 
Други ДНК полимерази участват в репарационната система на клетката,
чиято основна задача е да поправя грешки в ДНК възникнали под дейстието
на външни фактори-химични вещества, радиация. Такива са: ДНК
полимераза , ДНК полимераза , - присъединяват случайни нуклеотиди
срещу ТТ-димери.

Инхибитори на репликацията и приложението
им в медицинската практика
Структурни аналози на пиримидиновите бази:
- 5-fluorouracil –основен компонент на
химиотерапевтичните схеми
Инхибитори на бактериално делене
- cyprofoxacin – инхибитор на бактериалната гираза
Инхибитори на еукариотна топоизомераза I и
топоизомераза II
- Irinotecan; – topo I
- doxorubicin – topo II

Особен вид репликация протича в областта на теломерите и
при ретро вирусите, какъвто е HIV вируса. Това е
изключение от централната догма за пренос на генетичната
информация: ДНК  РНК  Белтък
Матрица за този тип синтез е
молекула едноверижна РНК.
Ензимите са от типа обратна
транскриптаза, които върху матрица
РНК синтезират едноверижна
комплементарна ДНК (кДНК).
Върху едноверижната кДНК се
изгражда комплементарна ДНК
верига, като се разгражда изходната
РНК.
 При ретро вирусите така
синтезираната двойноверижна ДНК
се интегрира в генома на клетката
гостоприемник.