Генетика - Теми

34.Краткосрочни тестове за мутагенност.Сестрински хроматидни обмени като тест за генотоксичност.Флуоресцентно in situ хибридизация(FISH).Кометен анализ.-Сестринските хроматидни обмени(SCE) представляват обмяната на новосинтезирана ДНК в точки на хомоложни хромозомни локуси.Доказано е,че SCE не е летално събитие за клетката.Честотата нараства при мутагенно въздействие,което показва че обмяната на хомоложни хроматидни участъци представлява механизъм за възстановяване на повредената ДНК.Експериментално е доказано,че най-високата честота на SCE се наблюдава след въздействието на S-зависими мутагени(предимно алкилиращи химични агенти).По-ниска е честотата след въздействие с антиметаболити и най- ниска с S-независими агенти(йонизираща радиация и др.).In situ хибридизацията може да се дефинира най-общо като хибридизация на място между ДНК или РНК проби на нуклеинови киселини върху цитологични препарати.Прилагането на метода флуоресцентна in situ хибридизация(FISH) за отчитане на структурни и бройни хромозомни аберации,повишава ефективността на специфичността за откриване на определен вид хромозомни аберации, индуцирани in vivo.Това са стабилни симетрични преустройства,хиперплоидия и сложни хромозомни преустройства.Кометният тест комбинира биохимични техники за установяване на едноверижни разкъсвания(брейкове)в ДНК молекулата,местата на непълно изрязване и репарация, лабилните към алкалии участъци,както и крос-линковете с метода на изследване на единична клетка,който е типичен за цитогенетичния анализ.Поради тази характеристика кометния анализ дава възможност и за преценка на кинетиката на ДНК репарацията в клетките след въздействието на генотоксични агенти.
35.Репарация на ДНК-генетична същност и биологично значение.Репарационни системи. Видове репарации.-Репарацията на ДНК е процес,чрез който клетката идентифицира и коригира настъпилата повреда.Колкото по-голям е геномът,толкова повече за възможностите за повреждане.Като повреда се означава всяка промяна в нормалната структура на ДНК,дължаща се на факторите на околната среда и на метаболитните процеси в клетката.Основните типове повреди на ДНК са:скъсване на фосфодиестерния скелет,което може да засегне едната или и двете вериги; загуба на бази; ковалентна модификация на база; въвличане на нуклеотид в неправилна ковалентна връзка с друг нуклеотид или друга молекула; неправилно сдвояване на бази.Някои типове повреди на ДНК могат да се поправят чрез пряка репарация.При тези механизми се отстраняват само повреди,които засягат една от четирите азотни бази и за репарацията не е необходима матрица.Най-важната от тези повреди е ковалентното свързване на пиримидинови бази от една и съща ДНК верига.Ексцизионната репарация може да коригира различни увреждания:пиримидинови димери,неправилно сдвоени базови двойки,едноверижни разкъсвания и др.В зависимост от повредения участък,ексцизионната репарация бива ексцизионна репарация на бази и ексцизионна репарация на нуклеотиди.По механизма на ексцизионната репарация на бази се поправят повреди засягащи отделни азотни бази.Ексцизионната репарация на нуклеотиди е по-неспецифичен механизъм за поправка на повреди в молекулата на ДНК.Тя репарира повреди, включващи по-дълги фрагменти-до 30 нуклеотида.Mismatch репаративната система поправя некоректно вмъкнатите бази.Чрез механизма на репарация чрез рекомбинация се репарират двойноверижни скъсвания в молекулата на ДНК.Рекомбинацията може да бъде хомоложна и нехомоложна.При хомоложната рекомбинация е необходимо в клетката да има второ копие от същата ДНК молекула,което да служи за образец.При нехомоложната рекомбинация се осъществява директно свързване на двата края на скъсаната ДНК,като по този начин се губи наследствена информация.
36.Комбинативна изменчивост.Молекулярен механизъм на кросинговъра.-Наследствените изменения на свойствата и признаците на организмите,определяни от различното съчетание на хромозомите и гените в процеса на мейотичното делене на клетките и при сливането на мъжката и женската гамета в момента на оплождането се наричат комбинативна изменчивост.Комбинативна изменчивост се наблюдава само при хетерозиготните индивиди.Новите комбинации от гени се залагат още в момента на разделяне на хомоложните хромозоми през профаза I на редукционното делене.Комбинативната генетична изменчивост в популациите се увеличава от системното протичане на кросинговър между локусите на идентичните гени в хомоложните хромозоми. Синтетичният период преди мейозата е удължен,като по време на пахитенния стадий на първата профаза още се извършва репликация на определени сегменти ДНК.Кросинговъра протича на няколко етапа,като крайния резултат е образуването на рекомбинантни ДНК молекули от двете хомоложни родителски ДНК молекули.Във формиралият се бивалент,ендонуклеазата предизвиква едноверижни разкъсвания в двете хромозоми.Според модела на Мезелсон-Радинг едноверижно разкъсване протича само в едната хроматида на единия хомолог в бивалента.В мястото на скъсване започва репаративна синтеза,докато другата ДНК верига се измества и се вмъква в двойната верига на несестринската хроматида.При другия модел се предполага че настъпва двойноверижно разкъсване в едната молекула ДНК.
37.Ненаследствена изменчивост.-Част от изменените признаци не се предават в потомството, поради това че те са изменения само във фенотипа,без да е настъпила промяна в генотипа на индивида.Тази изменчивост се нарича фенотипна или още модификационна,а самите изменения- модификации.Модификациите се характеризират със следните особености:имат масов характер, пропорционални са на силата и продължителността на действие на фактора,имат приспособително значение,повечето модификации са обратими.Модификационната изменчивост доказва,че в поколенията се унаследяват не готовите белези,а възможността те да се развият и да се променят по определен начин и в определени граници.Границите,в които могат да се променят фенотипните варианти на даден признак при еднакъв генотип,се определят от действието на различни фактори на средата и се означават като норма на реакция.Нормата на реакция може да бъде много ограничена,а може и да варира в широки граници.Характерна за модификационната изменчивост е нейната обратимост.Когато изчезнат условията,който са предизвикали дадени изменения,по-бавно или по-бързо изчезват и самите изменения.Когато настъпят промени в околната среда,организмите се приспособяват към тях посредством различни модификации.За всеки отделен генотип съвкупността от модификационни изменения се определя от специфичната за него норма на реакция.Тя показва възможността на генотипа да осигурява изменчивост на даден признак в зависимост от промените в околната среда,което е от изключително значение за еволюцията.
38.Геномен анализ.Рекомбинантна ДНК технология-секвениране,създаване на рекомбинант- ни ДНК молекули,клонирани на ДНК,PCR,библиотеки от клонирани ДНК секвенции и генно инженерство.-Създадени са няколко различни метода за секвениране на ДНК и при всеки един от тях се използват рестрикционни ензими.Тези методи се базират на създаването на набор от едноверижни фрагменти,които имат за начало една и съща точка и завършват в една и съща база. Чрез прилагане на денатурация връзките между комплементарните вериги на ДНК се разкъсват. Това води до получаването на две самостоятелни вериги.Ако тези вериги бъдат поставени в определени оптимални условия те отново може да се обединят в двойноспирална ДНК.Този процес се нарича ренатурация.Ако веригите произлизат от различни източници,процеса се нарича хибридизация на ДНК.Взаимодействието между ДНК фрагмента и вектора се базира на създаването на рекомбинантна ДНК молекула,която след преминаването й в клетката приемник клонира в голям брой еднакви копия.Клонирането представлява процес на включване на ДНК фрагменти в друга ДНК,която има способността да се самовъзпроизвежда в клетки-приемници и да създава голям брой копия на изходната рекомбинантна ДНК молекула.За да служи като вектор дадена молекула ДНК трябва да може да възпроизвежда себе си и всеки ДНК фрагмент,който носи.Плазмидните вектори са генетично модифицирани плазмиди,получени от естествено срещащи се в природата двойноверижни ДНК молекули,които се възпроизвеждат самостоятелно в бактериални клетки. Λ(ламда)-фаговите вектори са генетично модифицирани щамове на λ-фаги. Космидните вектори са хибридни форми,създадени чрез комбиниране на части от плазмиди. Изкуствените бактериални хромозоми са вектори с голям капацитет на клониране,вградени във фертилен плазмид (F фактор)на бактерия.Чрез полимеразна верижна реакция (PCR)се осигурява бързо клониране на ДНК и се елиминира необходимостта от използване на приемни клетки. Необходимите базови компоненти за PCR са:ДНК-матрица за осъществявания процес,получена след топлинна денатурация на специфична ДНК; Taq-полимераза-осъществява процеси на копиране на желаната ДНК последователност;праймери(зародиши)-представляват къси синтетични олигополинуклеотиди (14-40 нуклеотида),комплементарни на ограничаващите намножаваната последователност участъци; дезоксирибонуклеотидтрифосфати-служат като субстрат за изграждане на новосинтезиращата се верига,като се включват избирателно на принципа на комплементарност; реакционен буфер-осигурява подходящо рН на средата и необходимите йони за работа на ензима; термоцайклер-устройство,което загрява и охлажда реакционните епруветки до точната температура,необходима за всяка стъпка на реакцията. Наборът от клонирани ДНК секвенции,получени от един единствен индивид представлява една клонирана библиотека.В идеалния случай геномната библиотека съдържа поне едно копие от всички последователности в генома на един организъм.Хромозомно-специфичната библиотека е създадена от субгеномна фракция,съдържаща нуклеотидни последователности на една хромозома. Генното инженерство включва молекулярно-генетични манипулации от страна на човека за целенасочено изменение на генетичната информация на клетки и организми.Един от използваните методи е прехвърлянето на ген в оплодена яйцеклетка.Това води до получаването на организъм който съдържа в генома си новия ген и ще го предава на своите потомци.
39.Геномика,протеомика и метаболомика.Основни методи използвани при геномния анализ.- Геномиката има за цел изучаването на цели геноми на различни представители на организмовия свят.Основното поле на изследванията включва определянето на всички нуклеотидни последователности на ДНК на отделни биологични видове.В геномиката се оформят няколко основни поднаправления-структурна геномика,функционална геномика и сравнителна геномика. Структурната геномика изучава нуклеотидните геномни последователности,картографирането на ДНК секвенциите,локализацията на гените и др.Функционалната геномика изучава функцията на гените,регулацията на генната експресия и реализацията на информацията,записана в генома, включваща цялостния процес на генното действие и формирането на крайния генен продукт. Сравнителната геномика се занимава със сравнителни анализи на геноми и протеинови последователности,търсейки функционални и еволюционни връзки.Протеомиката изучава пълния набор от протеини,съдържащи се в дадена клетка в определен момент и при определени условия, както и структурно-функционалните свойства на белтъчните молекули.Метоболомиката е научно направление,изучаващо клетъчните метаболити и метаболитните процеси в контекста на функционалната геномика.При провеждане на геномния анализ генетичните лаборатории използват два основни метода за секвентиране на геномите- „клон-по-клон“ и „ловна пушка“. Метода „клон-по-клон“ изисква изграждането на клонирани библиотеки на големи фрагменти, които включват всички молекули ДНК в генома на изследвания организъм.След това клонираните участъци се сглобяват в генетични и физически карти,включващи целия геном.Метода „ловна пушка“ се базира на напредъка в развитието на технологиите за секвениране и разработване на специализиран високоефективен софтуер,които дават възможност да бъдат събрани нуклеотидни последователности от много къси,припокриващи се клонове в ед