Молекулярна биология - ГМО

Лекция на тема: ГМО
Д-р Цветослав Койнарски DVM, MSc, PhD
МОЛЕКУЛЯРНА
БИОЛОГИЯ

ГМО диня с квадратна форма?
•Макар да изглеждат необичайни, тези дини не са генетично
модифицирани. Те просто се отглеждат в кутия.

Не генетично модифицираните овесени ядки са
по-добрият избор от алтернативните?
•Всъщност няма алтернатива. Магазините не продават
генетично модифициран овес, защото не съществува!

Белите ягоди са променени в лаборатория?
•Всъщност: Те са създадени чрез старомодно кръстосване. Развъдчиците
кръстосали два вида ягоди, за да създадат белият вариянт.

Безсемковите дини са генетично модифицирани?
Японски генетици създават
безсемкови дини през 30-те
години на миналия век, като
начинът за тяхното получаване е
чрез третиране на дините с
алкалоида колхицин. Така броят
на хромозомите им бил увеличен
в двоен размер. В последствие
кръстосали новите дини с прашец
от обикновена диня. Потомството
получило нечетен брой
хромозоми, което е пречка за
формиране на собствени семена;
това не е резултат от чужда ДНК.

Генетичната мутация звучи страшно?
•Струва сида припомним, че генетичните мутации постоянно се случват в
природата без човешка намеса. Оранжевите моркови, например,
произхождат от естествена мутация и преобладават в нашето ежедневие
само защото хората ги засаждат. Виолетовите и жълтите, които може би
сте си помислили, че са ГМО, са оригиналните моркови.

Генетично модифицираната пшеница вероятно е
причината за чувствителността към глутен?
•Всъщност: Генетично модифицираната пшеница не се продава на пазара.
•За да бъде ясно, пшеницата е била генетично модифицирана. Монсанто има
полева пшеница, която е модифицирана за толерантност към хербицида глифозат.
Китайските изследователи променят пшеницата, за да се противопоставят на
болестта, наречена прахова плесен, но само за да видят дали могат.

Огромните пилета са ГМО?
•През последните 60 години пилетата са станали
по-големи. Те растат по-бързо и изискват по-
малко храна за килограм прираст. Но въпреки
това, което можете да прочетете в интернет,
тяхната ДНК не е била манипулирана в
лаборатория.
♂Cornish x ♀Plymouth
Broiler

Погрешно схващане: G.M.O. етикетите
подчертават документиран риск за здравето.
•В проучване на Pew Research Center за 2014 г. само 37% от
американците вярват, че генетично модифицираните храни
са безопасни за консумация. Националните академии на
науките, инженерството и медицината съобщават, че "не
съществуват разлики, които да предполагат по-висок
риск за човешкото здраве" от Г.М.О. култури. Няма
доказателства, че ГМО в Северна Америка, където такива
продукти са част от диетата от 1996 г. насам, са допринесли
за по-висока честота на рак, затлъстяване, диабет, бъбречни
заболявания, аутизъм, хранителни алергии в сравнение с
Европа, където ГМО са рядко употребявани.
•Това не означава, че е невъзможно да се модифицира
растение или животно, което би било лошо за вас. Това е
било направено най-малко веднъж със соя, която не е била
пусната за търговска употреба, поради нейното алергенно
свойство (открито при рутинен скрининг).

Техники за трансформацияна растения
•Трансформацията на растения се превърна в
общоприет похват за доказване на различните
функции на растителната клетка от една страна и
подобряване на агрономическите характеристики
на културните растения от друга.
•Трансформацията на растителни организми зависи
в огромна степен от стабилността на въведената в
генома чужда ДНК. За постигане на това са били
разработени редица методи, а множество
растителни видове трансформирани.

Техники за трансформацияна растения
•Част от използваните за трансформация
методи са базирани на Agrobacterium,
патоген по двусемеделните растения,
който пренася част от своята ДНК в
растителната клетка.
•Поради факта, че щамовете Agrobacterium
не взаимодейства с едносемеделни
растения, за тяхната трансформация се
прибягва до употребата на т. нар.
директни методи за трансформация –
например бомбардирането с
микрочастици или биобалистиката.
Agrobacterium tumefaciens
Gene gun or a biolistic
particle delivery system

Едносемеделнии двусемеделни растения
•Едносемеделни (Liliopsida или Monocotyledoneae) е клас
покритосеменни растения. Името на класа идва от структурата
на семената, които обикновено имат един семеделен лист, за
разлика от двусемеделните, при които има два. Главният корен
не е развит, за това кореновата система е брадата. Листата са
прости с успоредно или дълговидно жилкуване и винаги
обхващат стъблото. Към тях се отнасят: Житни, Лилиеви (лук,
чесън, праз, лале, момина сълза), Палмови, Салепови
(орхидеи), Перуникови.
•Двусемеделните (Magnoliopsida) са клас растения
принадлежащи към отдел Покритосеменни (Magnoliophyta).
Включва в себе си най-разнообразни по външен вид и размери
видове, от едногодишни растения до дървета. Имат зародиш с
два семедела. Към тях се отнасят: Бобови, Картофови,
Устноцветни, Сложноцветни, Розови, Кръстоцветни, Тиквови.

Agrobacterium-опосредстван генен трансфер
•Agrobacterium tumefaciens е патогрен който
предизвиква формиране на туморни
образования при редица важни
селскостопански култури като: лозя,орехи,
ябълки и рози.
•Патгеността на щамовете Agrobacteriumе в
пряка зависимост от възможността за
пренос на бактериални гени в растителния
геном. Това е един уникален пример за
трансфер на гени между организми
принадлежащи към различни царства, факт
който предизвиква определен научен
интерес и дава добра основа за създаване
на методи за трансформация на растения.

Ракови заболявания при растенията
индуцирани от Agrobacterium tumefaciens
•Agrobacterium tumefaciens е пръчковидна, подвижна бактерия, която
нормално обитава ризосферата и набавя необходимите и хранителни
ресурси от кореновите ексудати на растенията. В случай на
нараняване или увреждане на растителните тъкани бактерията
запоява да се проявява като патоген и на нараненото място много
скоро могат да се установят симптомите на заболяването. Самата
бактериална клетка разпознава и се придвижва до наранения участък
посредством хемотаксис, като отговор на отделените от растителните
тъкани фенолни съединения и монозахариди.

Ракови заболявания при растенията
индуцирани от Agrobacterium tumefaciens
•Развитието на рокoви симптоми зависи от наличието на
плазмид в Agrobacterium tumefaciens известен като Ti
(Тумор-индициращ). Една част от този плазмид, наречена T-
ДНК носи гени отговорни за синтеза на ауксини и
цитокинини от една страна и на нови за растителната клетка
метаболити: “опини”, производни на алфа-аминокиселините
и “агропини”, производни на захаридите. Синтезираните
ауксини и цитокинини водят до пролиферация на
растителните тъкани, а продуцираните опини се използват
от клетките на Agrobacterium tumefaciens като източник на С
и енергия. Опините и агропините не са естествени за
растителната клетка метаболити, характеризират се свисока
стабилност и не участват във физиологичните процеси на
растителните клетки. Следователно Agrobacterium
tumefaciensе придобил възможността да трансформира
генетично растителните клетки с оглед узурпиране на
биосинтетичния апарат на растителната клетка за свои цели.

Ti-плазмид
Размерът на Тi плазмида е около 200
kbp. Анализът на хромозомната,
растителна ДНК, изолирана от
Agrobacterium индуцирани тумори,
показва, че част от Ti плазмида е
инкорпориран в генома на
растителната клетка. Тази ДНК,
отговорна за формирането на тумори
е получила наименованието
трансферна ДНК (T-ДНК). Доказано е,
че Т ДНК може да се инкорпорира в
едно или повече копия на геном, но
винаги областите които се инсертират
са фланкирани от малки (24 bp)
обратни повтори, наречени бордери.

Ti-характеристики
Плазмидите на различните щамове Agrobacterium
tumefaciens имат няколко общи особености:
1.Съдържат един или повече Т-ДНК региона
2.Съдържат vir регион
3.Имат начало на репликация
4.Притежават регион отговорен за конюгативния
трансфер на ДНК
5.Съдържат гени отговорни за метаболизиране на
опини.

Т-ДНК
•Т-ДНК на кой да е Ti-плазмид е ограничена от ляв и десен
бордер. Тези бордери представляват непълни повтори от 24 bp.
Всяка ДНК, намираща се между двата бордера ще бъде
трансферирана в растителната клетка.
•При нопалиновият тип Ti плазмиди Т-ДНК има размер от
порядъка на 20 kb, при тези от октопинов тип са установени два
Т-ДНК региона, означени респективно като TL и TR с размери
както следва 14 и 7kb. При това само TL е онкогенен , а TR носи
гените за синтез на опини.
•При T-ДНК на нопалиновите Ti плазмиди са установени 13
отворени рамки на четене (ORFs), като в TL са локализирани 8 от
тях. Тези оперони имат по-скоро еукариотни отколкото
прокариотни характеристики. И при двата типа плазмиди по
отношение на Т-ДНК регионите им е установена висока степен
на хомология и по-специално в областта означена като “core”.
Този регион носи гените участващи в синтеза на хормони,
опини и определя размера на туморите.

Онкогенезис
•Два гена auxA (или tms1 или iaaM) и
auxB (или tms2 или iaaH) кодират
протеини участващи в синтезата на
ауксина ИОК. auxA кодира триптофан
монооксигеназа, а auxB кодира индол
ацетаминдехидрогеназа.
•Друг ген cyt (или tmr или ipt) кодира
изопентинил транфераза, която
катализира най-важната стъпка при
синтеза на цитокинини.
•Тези гени за първичните
детерминанти на туморния фенотип и
следователно се определят като
онкогенни. TR регоина на
октопиновата Т-ДНК не кодира
онкогени, което обяснява и липсата
на онкогенност.

Virрегион
•Гените отговорни за трансфера
на Т-ДНК в растителните
клетки обхващат област с
размер около 40 kb и са
локализирани извън Т-ДНК.
Тази част от Ti плазмида е
известна като vir (от
вирулентност) регион.
•Тази област включва най-
малко девет различни
оперона, като функцията на
по-голяма част от тях е
изяснена.

Т-ДНК трансфер и интеграция
1. Разпознаване на специфични сигнали от Agrobacterium
•Agrobacterium има способността да
разпознава някои специфични сигнали,
като фенолни съединения и захариди,
отделени от наранени растителни клетки.
Нормално тези съединения са част от
защитната система на растениети и се
свързват най-често със синтеза на
фитоалексини, лигнини. В същото време те
са и сигнал за наличието на клетки
подходящи за трансформация.

Т-ДНК трансфер и интеграция
2. Прикрепване към растителните клетки
•Това е двуетапен процес включващ първично,
обратимо свързване посредством
полизахариди (продукти на aatR локуса). В
последствие се формират целулозни фибри,
като в този процес взимат участие няколко
локализирани в хромозомата, бактериални
гена (chv). Гените chvA и chvB участват в
синтеза на бета 1-2 глюкани а pscA в
секрецията на суциноглюкан. Мутантните по
един от двата гена chvA или chvB са
авирулентни или много слабо вирулентни.

Т-ДНК трансфер и интеграция
3. Индукция на vir гените
•VirA има свойството да взаимотейства с
извънклетъчни сигнални молекули, като например
N-ацетосирингон, в резултатна което се
автофосфорилира, а впоследствие фосфорилира и
респективно активира virG. VirG от своя страна
индуцира vir гените. Много захариди като: глюкоза,
ксилоза, галактоза и др. могат допълнително да
индуцират vir гените. Този ефект обаче е зависим от
функцията на друг хромозомен ген означен като
chvE, който кодира глюкозо/галактозо транспортер
и респективно модулире взаимодействието с virA.

Т-ДНК трансфер и интеграция
4. Синтез на Т-ДНК
•Комплексът VirD1/VirD2 разпознава
секвенцията на десния бордер, при което
VirD2 генерирa nik, свързава се ковалентно
към 5’ края и измества едната верига. При
това се синтезира нова верига ДНК. VirC1
може да подпомогне този процес.

Т-ДНК трансфер и интеграция
5. Експорт на Т-ДНК
•Т-ДНК/VirD2 комплексът се експортира от
бактериалнта клетка през т.нар. Т-пилус,
продукт на virB оперона и на virD4. VirE2 и
VirF също се експортират от бактериалната
клетка.