Молекулярна биология - клониране и трансгеноза

Какво е клонинг?
•Клонинг е генетично копие на друг жив или мъртъв
организъм. Генетичният материал на клонираното
потомство се извлича от един източник, а не е
комбинация от гени от сперматозоид и яйцеклетка.
•Клонирането е процес на създаване на организъм,
който е точно копие на друг. Това означава, че
нуклеотидната последователност на ДНК е напълно
еднаква!
•"Клонингите са генетични копия на даден
организъм и са подобни на иднояйчните близнаци,
но родени по различно време".

История
•Hans Spemann (1938) предлага използването на ядрен
трансфер за клониране на организъм. Тази идея
произтича от теоретичните съображения на
експериментален метод, който би позволил да се
определи дали по време на клетъчната диференциация
настъпва загубата на генетичен материал. Ако това е така-
клонирането няма да бъде възможно.
•John B. Gurdonannounced(1958) съобщава, че е клонирал
южноафрикански жаби (Xenopusleavis), използвайки
ядрото на напълно диференцирани възрастни чревни
клетки. Това показа, че генетичният потенциал на клетките
не намалява, когато клетката се специализира.
•Ian Wilmut(1996) –клонирането на първият бозайник –
овцата Доли
•Wakayama (1998) –първата клонирана мишка.

Методи за клониране
•Ядрен трансфер
•Разделяне на ембриони
•Разделяне на бластомери

Ядрен трансфер от соматична клетка
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)
•В генетиката и биологията на развитието, ядреният
трансфер от соматични клетки (SCNT) е лабораторна
стратегия за създаване на жизнеспособен ембрион от
соматична клетка и яйцеклетка. Техниката се състои
във вземане на енуклеиден ооцит (яйцеклетка) и
имплантиране на донорно ядро от соматична клетка.
Използва се както в терапевтичното, така и в
репродуктивното клониране.

Ядрен трансфер от соматична клетка
•Процесът на ядрентрансфер от соматични клетки включва две различни
клетки. Първата е женска гамета -яйцеклетка. При експериментите с хора
тези яйцеклетки се получават чрез съгласие на донорите, като се използва
овариална стимулация. Втората е соматична клетка -произволна клетка от
човешкото тяло. Кожните клетки, мастните клетки и чернодробните клетки
са само няколко примера. Ядрото на яйцеклетката донор се отстранява,
оставяйки я "депрограмирана". Това, което е останало, е соматична клетка и
денуклеирана яйцеклетка. След това те се сливат чрез вмъкване на
соматичната клетка в "празната" яйцеклетка. След като се вмъкне в
яйцеклетката, ядрото на соматичната клетка се препрограмира (изтриване и
ремоделиране на епигенетични белези, като ДНК метилиране например).
Яйцеклетката, съдържаща ядрото на соматична клетка, се стимулира чрез
електрически шок, което провокира клетъчно делене. Така яйцеклетката е
жизнеспособна и способна да произведе възрастен организъм, съдържащ
цялата необходима генетична информация само от един родител.
Развитието ще се осъществява нормално и след много митотични деления,
тази единична клетка образува бластоцист (ембрион с ранен стадий с около
100 клетки) с идентичен геном с оригиналния организъм (т.е. клонинг).
Стволовите клетки могат да бъдат получени чрез разрушаване на този
клонинг ембрион за използване при терапевтично клониране или в случай
на репродуктивно клониране, клонинг ембриона се имплантира в майка
гостоприемник (сурогатна майка).

Ядрен трансфер, използващ бластомери или
култивирани клетки като ядрени донори

Ядрен трансфер от соматична клетка(SCNT)
•Предизвикателства:
•Препрограмиране на ядрото от диференциран етап
(соматични клетки) до ембрионален стадий
•Напълно активиране на гените е необходимо
условие за ранното ембрионално развитие.
•ДНК метилиране!

Инактивирането на гени е резултат от
метилирането на ДНК
•На молекулно ниво инактивирането се свързва с добавянето на
метилова група (СНЗ) към цитозиновите молекули, които се появяват
непосредствено на 5’ края на гуанинови молекули. Инактивирането е
свързано с метилиране на цитозини в така наречените CpG острови,
където с р се означава фосфатната връзка между двете съседни бази.
Потомците на определена клетка, в която първоначално е възникнало
инактивиране на определен ген, запазват същият ген в неактивно
състояние (след всяка репликация, новосинтезираното копие се
метилира идентично с оригинала). Новата верига автоматично се
метилира в същите CpG сайтове. При нормално протичаща мейоза
или в началото на ембрионалното развитие, метилираните участъци
се нулират. Така метилирането е допълнителен начин за контрол на
генната експресия. При клонирането това е основният проблем за
репрограмиране на трансферираното ядро, където голяма част от
гените са в неактивно (метилирано) състояние.

Репрограмиране
•Препрограмирането се отнася до изтриване и ремоделиране
на епигенетични маркери, като ДНК метилиране, по време на
развитие на бозайници или в клетъчна култура.
Метилираните участъци в ДНК се изтриват, което възвръща
активността на всеки ген през ембрионалното развитие.
Почти всички метилирани участъци от родителите се
изтриват, първоначално по време на гаметогенезата и отново
в ранната ембриогенеза, като всеки път се извършва
деметилиране и ремеметилиране. Деметилирането при
ранната ембриогенеза се осъществява в
преимплантационния период на два етапа -първоначално в
зиготата, а след това през първите няколко цикъла на
ембрионална репликация на морула и бластула. След това се
осъществява вълна от метилиране по време на етапа на
имплантиране на ембриона. Това води до глобална репресия
и позволява да се експресират housekeepingгенитевъв
всички клетки. В пост-имплантационния стадий,
метилираните участъци са специфични за стадия и тъканите
на организма. Така се постига диференциацията на клетките в
зависимост от тъканта която формират.

ДНК метилиране и препрограмиране по
време на ембрионалното развитие
•След оплождането някои клетки от новообразуваният ембрион
мигрират към зародишния край и в крайна сметка ще се превърнат в
герминативни клетки (сперматозоиди и ооцити). Поради феномена на
геномен инпринтинг, майчините и бащинните геноми са
диференциално маркирани и трябва да бъдат правилно
препрограмирани всеки път, когато преминават през зародишен етап.
Поради това по време на процеса на гаметогенеза първичните
зародишни маркери трябва да бъдат изтрити и възстановени на базата
на пола на новоформираният ембрион.
•След оплождането, бащините и майчините геноми отново се
деметилират и реметилират. Това препрограмиране вероятно е
необходимо за активността на гените в новообразувания ембрион и
изтриването на придобитите епигенетични промени. Така зиготата
става тотипотентна. Манипулацията in vitro на предварително
имплантирани ембриони показва, че нарушаването на процесите на
метилиране има решаваща роля в клонирането на бозайници.

Ядрен трансфер от соматична клетка -
репрограмиране
•Денуклеираната яйцеклетка може да препрограмира
трансферираното соматично ядро в ембрионално състояние,
което позволява развието на нов организъм.
•По време на ядрения трансфер от соматични клетки, ооцитът
изключва тъканно специфичните гени (активирани в
трансферираното ядро) и отключва експресията на гените
свързани с ембрионалното развитие.
•Клонирането на бозайници от диференцирани донорни клетки
опровергава старата догма, че развитието е необратим процес.
Той показа, че ооцитът може да препрограмира ядрото на
възрастен индивид до ембрионално състояние, което позволява
развитието на нов организъм. Перспективата за извличане на
специфични за пациента ембрионални стволови клетки чрез
ядрен трансфер, подчертава потенциалното използване на тази
технология в регенеративната медицина.

Ядрен трансфер от соматична клетка
•Ядрото от тази
соматична клетка ще
бъде използвано за
клониране –генетичен
донор.
•Ядрото на яйцеклетката
ще бъде отстранено и
ще бъде основа за
развитие на генетичния
потенциал на
трансферираното ядро.

Ядрен трансфер от соматична клетка

Ядрен трансфер от соматична клетка

Разделяне на ембриони
•Разделяне на ембрион
на отделни клетки,
всяка от които
образува нов
ембрион.
•Това е най-простият
механизъм за
клониране.
Тригодишна Холщайн-фризийска млечна
крава и нейните генетично идентични
клонирани телета.

Клониране посредством разделяне на ембриона

Клониране посредством разделяне на ембриона

Разделяне на бластомери
•Външната обвивка се отстранява от 4-клетъчния
ембрион, което води до разделяне на отделни
ембрионални клетки (бастомери), които след това
се култивират in vitro, за да се развият
ембрионални клонове

Защо да развиваме клонинг технологията?
•Потенциални приложения от клонирането на
животни:
•Бързо намножаване на ССЖ с желани качества
•Бързо разпространение на превъзходни генотипове
•Производство на голям брой предпочитани мъжки
разплодници за нуждите на естественото развъждане
•Бърза реакция на промените на пазара
•Фенотипна оценка и подбор -Клонирането за
фенотипна оценка и селекция за наблюдение на ефекта
от различни условия на околната среда върху
фенотипове от различни линии на клонирани животни
повишава генетичния напредък чрез увеличаване на
точността на селекцията

Потенциални приложения от
клонирането на животни
•Опазване на животните чрез cryobanking на
соматични клетки от редки и застрашени
животни
•"Застрахователна полица" срещу по-нататъшни
загуби на генетичното разнообразие или
евентуално изчезване на диви животни
•Запазване на застрашените автохтонни домашни
породи, адаптирани към конкретни условия на
околната среда

Потенциални приложения от клонирането на
животни
•Човешка клетъчна терапия за лечение на нарушения в
тъканите, които не се обновяват и не се заместват:
диабет, мускулна дистрофия, увреждане на гръбначния
мозък, някои ракови заболявания, различни
неврологични заболявания
•здрави клетки от пациент могат да бъдат използвани за
получаване на терапевтична тъкан за трансплантация:
инсулин-продуциращи панкреатични клетки за лечение
на диабет
•произвеждащи допамин нервни клетки за болестта на
Паркинсон
•това може да бъде използвано и за генна терапия за
коригиране на генетичен дефект в соматичните клетки
(например мускулна дистрофия)

Потенциални приложения от
клонирането на животни
•Трансгенно приложение:
•култивираните клетки могат да бъдат генетично
модифицирани в лаборатория
•модификациите могат да бъдат проверени преди да
се извърши каквато и да е работа с животни
•желаните генетично модифицирани клетъчни линии
могат след това да се използват при ядрен трансфер

Трансгенно приложение на клонирането
•Трансгенната технология (трансгенеза) е била разработена и
усъвършенствана върху лабораторни мишки. От началото на 1980 г.,
стотици различни гени са въведени в различни видове мишки. Тези
изследвания са допринесли за разгадаването на генното регулиране,
развитието на тумори и имунният отговор. Трансгенните мишки са
изиграли главна роля при разглеждане на приложимостта и производството
на лекарства за хора. За да се осъществи трансгенеза при бозайници, чужда
ДНК верига може да се въведе чрез няколко основни техники:
1.Ретровирусни вектори, които инфектират клетки в ранен стадий на
ембрионално развитие.
2.Микроинжектиране в мъжкия пронуклеус на оплодена яйцеклетка
3.Въвеждане на генетично модифицирани ембрионални стволови клетки в
ранен стадий на развиващия се ембрион.

Ретровирусен метод
•Използването на ретровирусния вектор има предимството
да бъде ефективен начин за интегриране на трансген в
генома на реципиентната клетка. Ретровирусите имат РНК
геноми, които се използват като шаблон за обратна
транскриптаза за синтезиране на ДНК репликон, който
може да бъде вмъкнат в генома на клетката хазяйн.
Въпреки това, векторите, получени от тези вируси, могат да
прехвърлят само малки фрагменти ДНК (до 8 кило бази).
Ограничението на размера понякога води до отсъствие на
важни фланкиращи последователности, важни за
експресията на трансгена.
•Въпреки, че тези вектори са проектирани с променени
репликационни механизми, геномът на ретровирусния
щам, необходим за гене