Молекулярна биология - репликация на ДНК

Д-РЦВЕТОСЛАВКОЙНАРСКИDVM, MSC, PHD

РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК
Приемственосттамеждупоколениятаиустановяванетонамеханизмите,
коитояобуславятеедноотнай-вълнуващитеоткритиявбиологията. След
доказванеролятанамолелулатанаДНК, катонисителнанаследствената
информация, сезадававъпросът: Каксесамовъзпроизвеждатазимолекула
икаксепредаваотпоколениенапоколение? Следдоказванетона
двойноспиралнатаструктуранаДНК, УотсъниКрикпредлагатимоделпо
койтомолекулатасе„размножава“. Потехнитепредположения, двойната
спираласеразплитаивсякаеднаотверигитеслужикатоматрицазасинтез
нановакомплементарнамолекула. Впоследствиевсяканова
двойноверичнаДНКспиралаеизграденаотеднановосинтезиранаиедна
стараверига. Благодарениенапроницателносттанатезидвама
изследователи(работещипредимносмолекулнимодели), тези
предположениябилиексперименталнопотвърдени.

ПРИНЦИПНАРЕПЛИКАЦИЯТА
ТеоретичносавъзможнидвамеханизмазарепликациянаДНК:
Консервативен–предполагасе, чеследразделянетонадвойнатаверига, всякаот
веригитеслужикатоматрицазасинтезнановаверига. Вкраянапроцесаполученитедве
двойниверигисеразделят, катоизходните„матрицисесъединяват(сглобяват) и
възвръщатизходната„майчина“ верига. Отдругастранадветеновикопиясъщосе
съединяватнапринципанакомплементарносттаиоформятизцялоновадъщернаверига
ДНК. Тозимеханизъмебилпървоначалнахипотеза, новпоследствиеебилотхвърлен.
Полуконсервативен–следразделянетонародителскатаверига, дветеедноверижни
молекулислужаткатоматрицазасинтезнановакомплементарнаверигаДНК. Следкрая
напроцесасеобразуватдведвойноверижнимолекули, всякаоткоитосъдържаедна
родителскаиеднадъщернаверигаДНК. Следогроменбройекспериментиедоказано, че
репликациятанаДНКсеизвършваименнопополуконсервативниятмеханизъм.
Предполагасе, чееволюционноклеткатаепредпочелатозиначиннарепликация, тъй
катотойнеизисквадопълнителноразделяненаверигитеипрегрупиранетоим.

ТОЧКА НА ИНИЦИАЦИЯ И ПОСОКА
НА РЕПЛИКАЦИЯТА
МолекулатанаДНКсесрещавдвеосновниформи:
Линейна–приеукариотите.
Кръгова–прибактериите, някоифагиивируси, плазмидитеидр.
Ипридветеформи, репликациятавинагизапочваотточноопределеномястонаверигата, означавано
катоточканаинициация. Прикръговитемолекулисенаблюдаваналичиетонаеднотаковамясто,
докатоприлинейнитеДНКмолекулисенаблюдаватмножествоначаланарепликацията. Инициацията
нарепликациятазапочваоттезиначалниточкиисеизвършвавдветепосоки, т.е. процесъте
двупосочен. Структурата, коятосеобразувавмястотонарепликацията, сенаричарепликативнавилка.
Участъккойтоводиначалотосиотеднаточканаинициациясенаричарепликон, акраятнавсеки
репликонсебележиотмястотовкоетосесрещнатдвесъседнирепликативнивилки. Кактовече
описахме, приеукариотитесъществуватмножествоточкинаинициация, коетообясняваиогромният
бройрепликони(едновременнореплициращисеучастъци) притях. Приповечетобактериигеномъте
съсредоточенведнакръгламолекулаукоятосеоткривасамоеднаначалнаточкаирепликациятапри
тяхпротичасединрепликон. Притяхрепликативнитевилкисесрещатприблизителнона180°от
началнататочка, порадиприблизителноеднакватаскоростнапротичаненапроцесавдвете
противоположнипосокинарепликона.

ПРОСТРАНСТВЕНА ОРГАНИЗАЦИЯ НА ДНК И
ЕНЗИМИ, УЧАСТВАЩИ В НЕЙНОТО ПОДДЪРЖАНЕ
ПредложенитедвеформинаДНКсаидеализиранмодел. Вприродатмолекулитена
ДНКняматтакиваидеалниформи. Задасепобераттезидългимолекуливклеткитете
сенамиратвтаканареченатасуперспирализиранаформа. Товаважикактозакръговите
такаизалинейнитеформинаДНК. СуперспирализациятанаДНКсеосъществява
посредствомдопълнителнотозавъртане(надясно) надветедяснозавитивериги. При
товадопълнителнозавъртанеоколособственатасиос, всякакръговамолекулаДНК,
придобивалинейнаформа. Следователнонаблюдавайкисуперспирализирани
молекули, небихмемоглидапредвидимтяхнатаформа. Приотрицателната
суперспирализация, дветеверигисезавъртатвпосокаобратнананормалнатаДНК
спирала, т.е. завиватсеналяво. Врезултатнатовазавъртанесеполучаваразхлбванена
двойнатаспиралаитяпреминававт. нар. релаксираносъстояние. Получените
различниформиврезултатнасуперспирализациятасенаричаттопоизомери. Кактопри
повечетопроцесивклетката, исуперспирализациятаеензименпроцес. Ензимитекоито
предизвикваттовадопълнителнозавиванесеозначаваткатотопоизомерази.

ТОПОИЗОМЕРАЗИ
Теосъществяватсвоятафункциячрезвременноразкъсваненаеднаотверигитеи
формиранетонавременнафосфодиестернавръзкамеждутирозиновостатъкотензимаи
единияоткраищатанаразкъсанатаверигаДНК.Следзавъртанетонаверигитееднаоколо
друга, топоизомеразителигиратразкъсанитекрайща. Катотопоизомеразивклетката
действатняколкоензима. Едниоттяхпредизвикватразкъсваненасамоеднаотверигите
(класI топоизомерази), докатодругипредизвикватразкъсванетоинадветевериги(класII
топоизомерази. Впроцесанарепликациятадветеверигисеразделятзадапослужаткато
матрицизасинтезнановиДНКкопия. Приразделянетоимобачесенамесватензимитена
суперспирализацията. НормалноДНКедяснозавитамолекула, впървитемоментисе
предизвикваотрицателнасуперспирализация, коетоводидорелаксираненамолекулата.
Впоследствиеспирализациятасезадълбочаваиседостигадомоментприкойто
молекулатаетолковасвръхспирализирана, черепликативнатавилкасеблокира. Втози
моментсенамесваттопоизомеразитеипредизвикватотрицателнаспирализация
(наляво). Потозиначинмолекулатапридобиваотноволинейнаформаирепликацията
продължава.

ТОПОИЗОМЕРАЗИ

ПОСОКА НА НАРАСТВАНЕ НА
НОВОСИНТЕЗИРАНИТЕ ВЕРИГИ
РепликациятаеензименпроцесосъществяванотензиминаричаниДНК
зависимиДНК-полимерази. Теизграждатковалентна5’,3’-фофодиестерна
връзкамеждуотделнитенуклеотиди, следейкизаправилното
комплементарносвързване, спрямоизходнатаматрица. Субстратиенергиен
източникнапроцесасеявяватсвободнитенуклеозидтрифосфатив
клетката.
РепликациятанаДНКвинагипротичавпосокаот5‘ краянаверигата, към
нейният3‘ край, порадивкоетовклеткатанесеоткриватензимикоитоимат
способносттадаприсъединяватнуклеотидивобратнатапосока.
ДветеверигинаДНКсаантипаралелни, т.е. акоеднатаверигазавършвас
5‘край, токомплементарнатананея, щезавършвас3‘ край, отсъщата
страна.

В КАКВА ПОСОКА НАРАСТВАТ ДВЕТЕ
ВЕРИГИ В РЕПЛИКАТИВНАТА ВИЛКА?
Установеное, черепликациятанаеднатаверигазапочваипротичаотедноначало(без
прекъсване), защототяпритежава5‘ край, откойтопроцесътможедазапочне. Тазиверига
сеотбелязвакатоводеща. Комплементарнатаверигаобачезавършвас3‘ крайипроцесът
неможедазапочнеоттозикрай. Притазиверигасенаблюдаватмноготочкинаинициация
(начала) откоитозапочвасинтезатанакомплементарнималкиверигиДНК, спосокаот5‘
към3‘. Отделнитефрагментиукоитосесинтезиратновикомплементарниверигиса
нареченинаиметонатехниятоткривател–фрагментинаОказаки. Тъйкатопроцесътпри
тазиверигасеизвършвапо-бавновсравнениесводещата, тяенареченаизоставаща
верига. Приудължаванетонавсекиотделенфрагментраноиликъсносезастигадруга
началнаточка(другфрагмент). СвързванетомеждудватафрагментанаОказакисе
извършваспомощтаналигазите. Тезиензимиизграждатковалентнавръзкамежду
хидроксилнатагрупана3‘ краянаединиятфрагменти5‘фосфатнатагрупаотначалотона
следващиятфрагмент. Потозиначинвкраянапроцесаидветедъщернивериги
придобиватцялостен(нефрагментиран) вид.

РЕПЛИКАЦИЯТА НА ДНК СЕ ИЗВЪРШВА
ОТ 5‘ КЪМ 3‘ КРАЯ НА ВЕРИГАТА

ПРАЙМЪР???
Заинициациятанарепликациятаосвенсинтезиращензим(ДНКполимераза)
енуженималъкфрагмент(ДНКилиРНК) нареченпраймър. Къмтозикъс
участъквпоследствиесеприсъединяватновитенуклеотиди, комплементарни
наизходнатаверига.
ОбикновеноприрепликациятаролятанапраймърсеизпълняваоткъсиРНК
фрагменти, коетоотсвоястранаобясняваиучастиетонаРНКполимеразите, в
началниятетапнарепликацията. РНКполимеразитесаполимеризиращи
ензими, нонесенуждаятотпраймързадазапочнатсинтезата. Вкраяна
репликациятавновосинтезиранатавериганесеоткриватрибонуклеотиди,
коетоозначава, чепонякакъвначинтесеотстраняваткактоотводещата,
такаиототделнитефрагментинаОказакинаизоставащатаверига.

БЕЛТЪЦИ, ОСИГУРЯВАЩИ
ЕДНОВЕРИЖНИТЕ ДНК МАТРИЦИ
Впроцесанарепликациятаучастиевзематняколкогрупиензими. Кактовечепосочихме
топоизомеразитенамаляватнапрежениетопредрепликативнатавилка, аДНКиРНКполимеразите
присъединяватсвободнитенуклеозидтрифосфатикъмновосинтезиращатасеверига. Участиев
репликациятавзематидведругигрупибелтъци:
Хеликази–спомагатзапо-бързоторазрушаваненаводороднитевръзкимеждудветеверигина
майчинатаверигаДНК. Теиматсвойствотодасесвързватседноверижнитеучастъцивначалотона
репликативнатавилкаиизползвайкиенергиятаотаденозинтрифосфатите(АТФ) разрушават
водороднитевръзкимеждудветеверигинаДНК. ПрибактериятаE. coli саоткритидвехеликази.
Еднатасесвързвакъмизоставащатаверигаиседвиживсъщатапосокапокоятотечерепликацията
(5‘-3‘). Другатахеликаза(Rep-белтък) сесвързвакъмводещатаверигаиседвиживпосокаобратнана
посокатанарепликацията(3’>5’)
БелтъцисвързващиедноверижнаДНК–иматсвойствотодапокриват„оголените“ едноверижни
участъциотДНК(поддействиетонахеликазите), катопотозиначинпредотвратяватобратнотоим
свързване. ТезибелтъциприE.coli саизградениот177 аминокиселиниипокриватучастъкот32
нуклеотидаотДНК. Характернозатяхе, чеприсвързванетонатакъвбелтъквединучастък, инициира
свързванетонабелтъцитеисъссъседниучастъци. Товаявлениееописанокатокооперативно
свързване.

ЕНЗИМИ УЧАСТВАЩИ В ПРОЦЕСА
НА РЕПЛИКАЦИЯ
Кактовечеописахме, вначалотонапроцесарепликазиясенамесваензимътРНК
полимераза, койтосинтезиракъсиверигиотРНК(праймър). Тезиверигисезахващатза
началатаразположенипоДНКверигатаиензимътДНКполимеразазапочвадасинтезира
новаверига. ПорадиразличиятаимсРНКполимеразитеучастващипритранскрипциятана
гените, РНКполимеразитесинтезиращипраймър, сеозначаватсиметопримази. При
бактериятаЕ. coli примазатапредставляваполипептид, активиращсесамовприсъствието
наняколкодругиполипептида. Комплексътотпримазатаидопълнителнитебелтъчинисе
ознаяава, катопримозома. Примозоматаизпълняваследнитефункции:
1.РазпознаваточкитенаинициацияподължинатанаДНКверигата.
2.Полимеризациянарибонуклеотидиипревръщанетоимвпраймър.
3.Изместваненапокривнитебелтъчини, отедноверижнитеДНКвериги.
4.Придвижванеподължинатанарепликативнатавилка.

ДНК ПОЛИМЕРАЗИ
ПрибактериятаЕ. coli сеоткриваттривидаДНКполимерази–ДНКполимеразI, ДНКполимеразаII и
ДНКполимеразаIII. Кактовечесезапознатме, всичкиДНКполимеразииматсвойствотодасинтезират
новиДНКвериги, ноизискватналичиетонаДНКилиРНКолигонуклеотиди(праймър) откойтода
стартират. Най-важнароляприрепликациятаиграятензимитеДНКполимеразаI иIII. ЕнзимътДНК
полимеразаIII еотговорензасинтезатанаДНК, кактовъвводещатаверига, такаивъвфрагментите
наОказаки. Задаизпълняватазисифункциятойпритежава5’>3’ активност. Установенаеитака
нареченатаредактиращаактивностнатозиензим, изразяващасевотстраняваненапогрешновключени
нуклеотиди. Тазифункция(екзонуклеазнаактивност) сеобуславяот3’>5’ активносттанаензима, което
мупозволявадазаместванеправилновключенитенуклеотидиприсинтезатанаДНК. Въпреки
сравнителномалкиятбройнадопусканитегрешкиприрепликацията, редакционнатаспособностнаДНК
полимеразаIII давадопълнителнаточностнапроцеса. ДНКполимеразаIII еизграденаотдесетразлични
полипептиднивериги. Основнатачастоттяхсъставяттаканареченияткорензим, съставеноттри
субединици. Еднатасубединицапритежава5’>3’ екзонуклеазнаиполимеразнаактивност.
Редактиращатаспособностнаензимасеопределяотопределяотдругасубединицанакорензима,
притежаваща3’>5’ екзонуклеазнаактивност.Описаниятензимсеоткривавоколо20 копиявклетката,
катопризапочваненарепликацията, тойсезакрепвазаверигаДНКинесеотделяотнея, докатоне
достигнекраяти.

ФУНКЦИИНАДНКПОЛИМЕРАЗАI
1.Разгражданенапраймъраоткойтозапочварепликацията, използвайки5’>3’-екзонуклеазнатаси
активност.
2.Запълваненаобразуванатапразнина(ототстранениятпраймър) скомплементарнинуклеотиди.
Притозипроцесензимаизползва5’>3’-полимеризиращатасиактивностидобавянуклеотиди
към3’-ОН-краянапредходнияфрагментнаОказаки.
3.Проверяваиотстранявапогрешновключенитенуклеотиди(дублирафункциятанаДНК
полимеразаIII).
Тозиензимсенамиравпоголемиколичествавклетката(400 копия), катоосвенприрепликацията,
участваивпроцеситенарепарацияирекомбинациянаДНК.
Следзапълванетонапразнинатаототстранениятпраймъридоближаванетонадватафрагмента
наОказаки, дватакраясесвързватведнаобщаверига. Свързванетонакрайщатанадвасъседни
фрагментасеизвършваотензимаДНКлигаза, коятообразуваковалентнавръзкамежду3’-ОН-краяна
единияфрагментнаОказакии5’-Ф-краянаследващия.
Комплексътотвсичкибелтъчинив