Молекулярно биологични методи

МОЛЕКУЛЯРНО БИОЛОГИЧНИ МЕТОДИ

Приложението на молекулярно-биологичните методи в
медицината получи силен стимул с развитието на PCR
техниката. Тя дава възможност чрез амплифицирането
/намножаването/ на определени ДНК фрагменти да се осигури
достатъчно количество от определена част на генома на хора,
животни и микроорганизми за идентификация.

Молекулярно-биологични методи се използват в множество клонове
на медицината, вкл. вирусология, паразитология, онкология,
патология, са свързани с:
•Диагностика на генни мутации и полиморфизми
•Идентификация и количествено определяне на вирусен,
бактериален товар, паразитози и др.
•Прогноза на терапевтичния отговор (фармакогенетика;
персонализирана медицина)
•Установяване на вероятността за развитието на генно-
асоциирани заболявания
•Изучаване на молекулните патогенетични механизми на
редица болести

Молекулярно-биологични методи са основата на рекомбинантни
ДНК-технология използвани за синтез на ваксини, биологични
агенти за терапия, диагностика; генна тепария, създаване на
експериментални модели и т.н.

Основни методи на молекулярната биология в
медицината
•Полимеразно-верижна реакция - Polymerase chain reaction
(PCR); RT-PCR; Real-time PCR и др.
•Ресктрикционен анализ
•Техники за разделяне на ДНК фрагменти – електрофореза
•Хибридизационни методи– Southern, Northern, Western blotting
•ДНК секвениране
•Микрочипове – ДНК/РНК
Инструменти на молекулярната биология
•Ензими - Taq полимераза, ресктрикционни ендонуклеази,
обратна транскриптаза, ДНК лигази и др.
•Клетки – клетъчни култури, тъкани, бактериални клетки,
вируси.
•Организми – експериментални модели животни
•Апаратура, софтуер и специалисти

•Taq полимераза – ДНК полимераза изолирана от различни
видове термофилни бактерииThermus aquaticus
Полимеразно-верижна реакция - Polymerase chain
reaction - PCR
Основен ензим:
През 1985, Kary Mullis изобретил метод PCR като използва
термоустойчива Taq полимеразата, за което е удостоен с
Нобелова награда през 1993 година.
Kary B. Mullis

GeneAmp 9700
Тип блок-алуминиев,
взаимозаменяемост
96 проби за 0,2ml епрув./плаки
2x384 проби, за 0.02 ml плаки
Температуна област: 4.0°С –
99.9 °С, Peltier система
Нагряващ се капак
Автоматичен “Hot start”
Допълнителни настройки
Висока специфичност
Голяма чувствителност
Бързина
Лесна за автоматизиране
Широка област на
приложение
Апарат за класически PCR
PCR е техника отличаваща се с:

PCR  репликация in vitro но на определен/желан фрагмент

1.ДНК матрица
2.Праймери – двойка синтетични
олигонуклеотиди (прав (forward, F) и
обратен (reverse, R), които са
комплемтарни на матрицата,
разположени от двете страни на
интересуващата ни ДНК
последователност
3.Дезоксирибонуклеозид трифосфати–
(dNTPs), мономерите за изграждане на
ново-ситезираните ДНК вериги
4.Taq полимераза
5.Буфери и йони за са се създадат
оптимални условия за работа на ензима

•Термична денатурация (denaturation) на двойно-
верижната ДНК при 94С до пълно разделяне на
веригите
•Хибридизация (annealing) между праймерите и
комплементарните им секвенции от матричната ДНК.
Температурата на това взаимодействие е строго
специфична и зависи от базовия състав и дължината на
праймерите. Т = 2˚ С (n A/T) + 4˚ С (n G/C)
•Синтез в посока 53 (extension) на ДНК веригата
комплементарна на матрицата. Температурата на този
етап се определя от използвания ензим така, че да му се
осигури най-висока ДНК-полимеразна активност. (За Taq
DNA Polymerase тя е 72C).
PCR представлява многократно повтаряне на серия
от цикли, всеки от които включва три стъпки:

Полимеразно-
верижна реакция
Върху едноверижна
ДНК матрица ензима
ДНК-полимераза в
присъствието на
синтетични
олигонуклеотиди
(primers) и четирите
дезокситринуклеотиди
(АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ)
синтезира множество
копия от матрицата -
ампликон.

PCR резултат след
30 цикъла– милярди
копия на желания
фрагмент ДНК
Защо не използваме
ДНК полимераза
изолирана от
човешки клетки за
PCR?

Най-специфичният компонент на PCR микс са
праймерите
•Пример: молекулярен анализ чрез PCR-базирани тестове, е
подходящ метод за идентификация и разграничаване на
патогенния вид амеба (E. histolytica) от непатогенни видове (Е.
dispar).
•PCR-базирани методи: алел-специфичен PCR,
мултиплексен-PCR, „генздови“ PCR, RT-PCR, qPCR и др.
Праймери
комплементарни на
фрагмент от E. histolytica
Праймери
комплементарни на
фрагмент от E. dispar
•Проба 1, 3 – позитивни
за E. histolytica
•Probe 2, 4 – негатични
за E. histolytica
•Probe 6, 8 – негативни
за E. dispar
•Probe 7, 9 – позитивни
за E. dispar

Рестрикционени анализ
•Ампликонът се разкъсва от
специфични ендонуклеази,
нар.рестиктази на различни по
дължина фрагменти.
•Рестриктазите разпознават
точна секвенция (палиндроми)
•Два типа рестиктази в
зависимост от начина на
късане:
1. получават се
фрагменти с тъпи крайща
(Hpa I).
2. получават се
фрагменти с лепливи карайща
(Eco RI, Hind III);

Чрез комбинация от няколко рестриктази се получава набор от
фрагменти, които чрез електрофореза се разделят в зависимост от
дължината си.
Разликата в рестрикционните карти на два индивида от един вид
се означава като полиморфизъм по дължината на рестрикционните
фрагменти (restriction fragment length polymorphism – RLFP). Този
метод се използва за определяне на бащинство и детекция на
мутация.

RFLP-методът се използва за диагностика на точкови
мутации. Например за диагностика на сърповидно
клетъчна анемия

RFLP-методът се използва също в криминалистиката, за
определяне на бащинство и идентификация.
За идентификация се използват най-
често Variable Number of Tandem Repeats
(VNTRs) или Short tandem repeats (STRs)
- броя повтори е различен между хората
– DNA fingerprint

Рестрикрази – приложение в генно инженерство
•Рекобнинатни ДНК технологии – основа на генното инженерство
•Рекомбинантна ДНК – изкуствено получена ДНК от 2 или повече
различни източника
•Видове вектори- плазмиди,
бактериофаги, вируси,
изкуствено създадени
бактериални или дрождеви
хромозоми и др.

1.Изолиране на таргетен ген
2.Третиране с една и съща рестриктаза на таргетната последователност
и подходящ вектор
3.Лигиране
4.Трансформация/трансфекция на клетка-гостоприемник
5.Селекция на успешно трансфектираните клетки
6.Експресия на таргетния ген

Основни стъпки в генното инженерство
Cutting with
the same
restriction
enzyme

Молекулярно-биологични методи и
генно инжинерство-нови хоризонти в
медицината
•Молекулярно генетични методи и
генното инженерство са в
основата и на нови методи за
лечение, като генна терапия,
създаване на ваксини, създаване
на животински модели на
различни заболявания при човек
и много други.

Анализ на конформациите на едноверижни
нуклеинови киселини
Single-Stranded Conformational Polymorphysm (SSCP)
ДНК фрагмент се намножава чрез полимеразно-верижна
реакция (PCR)
Денатурация на двуверижната ДНК. PCR-продуктите при
ренатурация придобиват различна конформация
Електрофоретично разделяне на едноверижни фрагменти
ДНК в зависимост от конформацията им.
При една нуклеотидна замяна в даден фрагмент
конформацията му се променя.
Не може точно да се каже каква нуклеотидна замяна/мутация
е настъпила в ДНК фрагмента.
SSCP анализът е подходящ за фрагменти с големина до 350нд

Секвениране на ДНК - Oпределяне точната нуклеотидна
последователност, първичната структура на ДНК
•Секвениране по Максам и Джилберт – химично секвениране
•Използват се различни химични вещества, които късат
неспецифично ДНК в определен нуклеотид. Например, с
киселина-късане при А
•Секвениране по Sanger (1977) – ензимно секвениране на ДНК
•Next Generation Sequencing– от 2005
Frederick Sanger (1918-2013)
Английски биохимик с две Нобелови награди по
химия
1)През 1958 г. той е удостоен "за работата си
върху структурата на протеините, особено
тази на инсулин".
2)През 1980 г., заедно Джилберт "за техния
принос по отношение на определянето на
нуклеотидни последователности в
нуклеиновите киселини".

Секвениране по Sanger – ензимно секвениране на ДНК
•Синтез на ДНК върху
матрична едноверижна ДНК
с участието ДНК-полимераза
•Използват се нуклеотидни
аналози 2'-3'-
дидезоксинуклеозид 5'-
трифосфати (ддНТФ)
•При вграждане на тези
аналози изграждането на
ДНК веригата се стопира, тъй
като те нямат 3'-OH група.

В съвременните
автоматизирани
секвенатори се
използва
Секвениране по
Sanger, като
праймерите са
белязани не с
изотоп а с
фруоресцентен
маркер

Автоматичен ДНК секвенатор
ABI PRISM 310 GA
Принцип на анализа:

Капилярна електрофореза на
флуоресцентно белязана ДНК
1 капиляра – в.д. 50мкм, д. 47/61cм
Температура - 22 до 60°С
Напълно автоматична система
пълнене на капилярата, подаване
на буфер, електрокинетично
инжектиране на пробата,
провеждане на електрофорезата.
Специализирани софтуери за
събиране и анализ на данните
24 часа без намеса на оператор

Приложение в медицината
•ДНК секвениране - генотипиране по HLA гените.
•Обикновено фокусирано върху най-полиморфните екзони
на HLA-A, -B, -C и HLA-DR, -DQ, -DP гените.