Молекулярно биологични методи за диагностика

•Към всеки антигенен епитоп имунната
система продуцира антитяло с висока
специфичност и силен афинитет.
Принцип – всяко антитяло разпознава
и свързва само своя антигенен епитоп
•Изключения – кръстосана реактивност

•В реакцията могат да участват:
- Разтворими антигени
- Мембранно асоциирани антигени
- Имобилизирани антигени
- Антитела от различни класове
- Поли- и моноклонални антитела

Имобилизараните /immobilization –
обездвижване/ антигени са
прикрепени към някаква повърхност

Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA)
– ензим – свързан
имуносорбентен метод
Синонимна абревиатура –
EIA
Колориметричен метод за
определяне количеството на
антитела или антигени
Техниката е изобретена и
въведена за първи път от
Engvall и Perlmann през 1971

Eva Engvall
Peter Perlmann

•Използва се в диагностиката за
детектиране на:
- антитела от различни класове – при
инфекциозни и паразитни болести,
алергии, автоимунитет, след
ваксинации
- антигени – инфекциозни болести,
хормони, различни серумни протеини
/вкл. маркери на ракови заболявания/,
проинфламаторни и имунорегулаторни
цитокини

•Бърз
•Количествен
•Високо чувствителен
•Гарантира повторяемост на
резултатите
•Сравнително евтин
•Предлага се под формата на
стандартизиран набор от реагенти и
стандарти /кит/

Широко приложение за диагностика
в медицината, както и за целите на
експерименталната имунология

Плака за ELISA
Имобилизиран разтворим антиген или
имобилизирано антитяло
Проба на пациента
Детектиращи антитела конюгирани с ензим
Буфери
Субстрат на ензима за цветната реакция
Автоматични пипети, многоканална пипета
ELISA ридер

Полистиренови цели плаки или
модули /стрипове/
Високо адхезивни свойства
96 гнезда
-8 пътеки – A - H
-12 колони – 1 - 12
-Всяко гнездо има свои координати
– А3, В7, Н11 ......
-Преди провеждането на една
ELISA се прави схема на плаката
– при няколко пациента се описва
чия проба в кое гнездо се намира,
пробите се дуплицират

- Директна – антитялото конюгирано с ензим
/детектиращо антитяло/ директно се свързва с
антигена предмет на нашия интерес
- Индиректна – антигенът се разпознава от
антитяло и едва след това се прилага
детектиращото антитяло което е специфично
към първото
- Сандвичева – интересуващия ни антиген лежи
между два слоя специфични антитела. Второто
антитяло е детектиращото конюгирано с ензим
- Конкурентна - този вид ELISA се базира на
инхибиране на очаквания сигнал от конкурент
на един от компонентите на реакцията, антиген
или антитяло.
Capture Assay

Използва се за определяне на антитела в
серум, плазма или в други биологични
течности на пациенти

1.Гнездата на плаката се
сенсибилизират като се
натоварват с антигена към
който ще търсим
специфични антитела в
пробата на пациента
/серум, плазма/.
2.Накапва се пробата на
пациента. Ако в нея има
специфични антитела те се
свързват с антигена. В
гнездата се образуват
комплекси антиген-
специфично антитяло.
1
2
3
4

3. Накапва се детектиращото
антитяло – античовешки Ig
конюгиран с ензим. Антитялото
разпознава човешкия Ig в
гнездата и се свързва към него.
Използваният ензим може да
бъде АР /алкална фосфатаза/
или най-често РО /пероксидаза/.
В плаката се образуват
комплексите антиген-антиген
специфично антитяло-
детектиращо антитяло.


4. Прибавя се субстрата на ензима .
Безцветният субстратен разтвор се
конвертира в цветен продукт под
действието на ензима
5. Стопиране на реакцията и
измерване
1
1 2
2
3 3 4
4

Детектиращото антитяло може да бъде насочено към човешкия
IgG, IgM, IgE или IgA – неговата специфичност се определя от
това кой клас антитела в пробата на пациента искаме да
определим.
- Ако използваме анти-човешки IgM-PO, ще определим
количеството на антителата от клас IgM в пробата
- Ако използваме анти-човешки IgG-PO, ще определим
количеството на антителата от клас IgG в пробата
Тези два класа подлежат на определяне при бактериални,
вирусни и паразитни заболявания.
 - При алергични заболявания и хелминтози – анти-човешки
IgЕ-РО

 - При чревни паразитози – анти-човешки IgА-РО

Проба на пациент-
серум, плазма
Определяне на IgM
IgM
IgG
Anti-
human
IgM-PO
Anti-
human
IgG-PO
Ag

Използва се за:
- детекция на антигени от вирусни,
бактериални и протозойни патогени в проби
от пациенти
- количествено определяне на хормони,
цитокини, антитела от различни класове и
др.

1.Към плаката се имобилизират моноклонални
антитела специфични към един епитоп на
антигена който ще търсим в пробата – улавящи
антитела
2.Прибавя се пробата на пациента, ако в нея
присъства търсения антиген той се разпознава
и свързва от улавящото антитяло – образува се
комплекса улавящо антитяло-антиген.
3.Накапва се детектиращото антитяло което е
поли- или моноклонално специфично към друг
епитоп на същия антиген. Образува се
комплекса улавящо антитяло-антиген-
детектиращо антитяло.

4. Прибавя се субстрата – той се
конвертира от ензима в цветен
продукт.
5. Стопиране и измерване на
интензитета на цветната реакция

Биотинилирана ELISA
Използват се детектиращи
антитела свързани с биотин.
Той има висок афинитет към
стрептавидина, който е с
тетрамерна структура и носи
няколко ензимни молекули.
Това увеличава многократно
цветната реакция реализирана
от едно детектиращо
антитяло. Съответно -
повишава се
чувствителността на ELISA
теста към малки количества
на антигена.

•Цветната реакция в гнездата се измерва на
спектрофотометър - ELISA ридер, който заснема
интензитета на цветната реакция при определена
дължина на вълната. Реакцията се отчита в OD
(optical density) стойности.
•Колкото по – голямо е количеството на търсеният в
пробата на пациента компонент /антигени или
антитела/, толкова по-силна ще бъде цветната
реакция. Ако той липсва цветна реакция няма да
протече.

Зависи от ензима
и неговия субстрат
Измерва се на
специфична дължина на
вълната –PNPP 405 nm
субстрат за ензим АР;
492nm OPD - за РО,
450nm TMB – за PO

Тестовете за диагностика се продават заедно с положителна и
отрицателна контрола. Ако положителната контрола не се изяви
това показва че има проблеми с работата и тестът трябва да се
повтори. Ако отрицателната контрола надхвърля определените
стойности – също.
Тестът може да даде фалшиво позитивни резултати в пациентската
проба и поради кръстосана реактивност. Ако има такива съмнения
тестът на пациента трябва да се повтори след няколко дни или
седмици.
Тълкуването на валидните резултати и поставянето на диагноза се
прави от лекар специалист по съответното заболяване.
Лабораторията изготвя теста и предоставя резултатите.

- Високи нива на специфични антитела от клас IgM – първичен имунен
отговор, текуща първична инфекция
- Високи нива на специфични антитела от клас IgG – вторичен имунен
отговор, продължителна инфекция. При ваксинации активен протективен
имунитет.
IgG>IgM – хронична или рецидивидираща инфекция
- В пробата на пациента освен специфични антитела се намира и
антиген на инфекциозния агент /напр. HIV – gp120, HBV – HBsAg/
– остра или хронична инфекция

Инфектирано лице
небелязан
антитяло
Серум от
неинфектирано
лице
слаб детектиращ
сигнал
силен детектиращ
сигнал
При RIA вместо ензим за детекция на сигнала се използва радиоактивен изотоп
маркиращ антигена или детектиращото антитяло. В случая определено
количество от радиоактивно белязаният (I
125
) антиген се миксира с пробата на
пациента. Небелязаният антиген от пробата на пациента конкурира радиоактивно
белязаният антиген за свързването със специфичните антитела имобилизирани
към плаката. Колкото по-голямо е количеството на антигена в пробата на
пациента толкова по слаб е радиоизотпния сигнал отчетен от апаратурата.
Използва се за определяне на протеини, хормони, витамини, лекарства и др.
антигени в проба на пациент

- Метод за визуализиране и анализ на
антигени в тъканни проби чрез селективно
оцветяване посредством детектиращи
антитела конюгирани с ензим – РО
/пероксидазно оцветяване/, DAB
/диаминобензидиново оцветяване/ и др.
- Тъканта се обработва на тънки слайдове
- Те се третират с моно- или поликлонални
антитела последното от които е конюгирано с
ензим. Така на базата на специфичността на
реакцията антиген-антитяло се осъществява
локална цветна реакция там където е
разположен антигена предмет на нашия
интерес.
- Тъканният срез се наблюдава под
микроскоп и се заснема с фотодетекционна
апаратура. Резултатът може да бъде
обработен и посредством специален
компютърен софтуер.

- Броят, разположението и големината
на цветните петна показват
количеството и мястото на търсения
антиген в тъканния срез

За целта се
използват
моноклонални
антитела срещу
антигени
специфични за
конкретния вид
тумор – туморни
маркери или
такива които са
характерни за
делящи се клетки
Имунохистохимичен анализ на тъканна проба от сквамозно-клетъчен карцином в
устната кухина. Оригинал и компютърно обработен със софтуер. Използвано е
моноклоналното антитяло Ki67 срещу едноименния антиген който се среща в
ядрото на делящи се клетки – маркер на делящи се клетки (a) оригинална
сканираща фотография , DAB оцветяване в кафяво. (b) след компютърния анализ:
синьо – негативни ядра (0+); жълто 1 + ядра; оранжево 2 + ядра; червено 3 + ядра.

В метода се употребяват антитела към
клетъчни антигени конюгирани с
флуоресцентни маркери - флуорохром.
Могат да се наблюдават посредством
флуоресцентен микроскоп при което
флуоресценцията на клетки в пробата доказва
присъствието на търсения антиген. Използва в
диагностиката за анализ на:
- тъканни срезове
- кръвни клетки и клетъчни култури
Анти- PCNA /Proliferating cell nuclear
antigen /антитяло маркирано със зелен
флуорохром Флуоресцентен микроскоп
Имунофлоуресцентна микроскопия

Fluorescence activated cell sorting –
FACS - клетъчно сортиране – техника
за изолиране на клетъчни популации от
клетъчен микс на базата на
флоуцитометричната техника
Флоуцитометрия - автоматизирана и
компютъризирана техника за определяне и
анализ на клетъчни популации в кръвта
или тъканни хомогенати посредством
флуоресцентно маркирани антитела към
клетъчни протеини /CD молекули/

1.Разделяне на протеините чрез
електрофореза
2.Прехвърляне на протеиновите
ивици върху нитроцелулозна плака
3.Откриване на търсения протеин
чрез моноклонално антитяло
маркирано с:
-Ензим - специфично оцветяване на
ивицата
-Флуорохром – флуоресценция на
търсената ивици
-Радиоактивен изотоп – осветяване на
фоточувствителна плака
Уестърн блота е аналитична техника
използвана в молекулярната биология
за детекция на търсен протеин
/антиген или антитяло/ в проба -
тъканни хомогенати, екстракти,
серум, плазма и др. Използва се в
диагностиката за доказване на
заболяването. Например 52% от
пациентите с хронична лаймска болест
са негативни при ELISA теста, но
позитивни при Western blot
Мултиплексна
имунофлуоресцен
ция за 2 протеина