Молекулярно-биологични методи за оценка на генната експресия

Молекулярно-биологични методи
за оценка на генната експресия

Методи за оценка на генната експресия на ниво РНК
При тази група методи първа и задължителна стъпка е
изолиране на РНК като има два основни подхода:
Да се изолира обща тотална РНК  Да се изолира само иРНК
Стандартен метод за изолиране на обща РНК (иРНК; хяРНК;
тРНК; рРНК)
РНК е по-силно хидрофилна и по-лабилна молекула от ДНК.

Изолиране на зряла иРНК
Разработен на принципа на афинитетна хроматография в основата
на която са комплементарността на базите А=Т ( А=У) от поли-А-
опашката на процесираните иРНК.
Ако искате да изследвате експресията на ген за рРНК , ген за тРНК
и ген за цитокин от една проба, кой метод за изолиране на РНК
бихте предпочели Вие

Основни методи за измерване на нивото на генна
експресия на ниво транскрипция
1.Традиционни методи:
i.хибридизационни методи - Northern Blot
ii.полимеразно верижна реакция с обратна
транскрипция - RT-PCR
iii.PCR в реално време - Real time-PCR
2.Нови технологии
i.ДНК микрочипове - DNA Microarray
ii.Next Generation Sequencing (NGS)

1.Изолираната иРНК или обща РНК се
разделя в зависимост от молекулното
тегло чрез агарозна електрофореза.
2.Разделените РНК молекули се
прехвърлят върху нитроцелулозна
мембрана.
3.Идентифициране на интересуващата ни
РНК чрез белязана с
32
P специфична
сонда.


4.Полуколичествен метод
Хибридизационни
методи
Northern Blot
AUGGCAAUCUUGGC
32
P

Northern Blot
PEDF- Pigment
epithelium-
derived factor ,
познат още като
серпин F1
Изключително
силен анти-
ангиогенезен
фактор, чиято
функция се
регулира от
количеството
кислород
Понижена или
липсата на
експресия на
PEDF е
асоциирана с рак
на простата

Northern Blot
Предимства
Лесен, добре изучен и рутинно
прилаган метод
Не скъпо струващ
Висока специфичност
Недостатъци
Полуколичествен метод
“опасен” метод-използване на
радиоактивно белязани сонди
Опасност от контаминация с РНАзи
Чрез Northern blot не може да се каже
колко копия иРНК на гена има, а колко
пъти е променена генната експресия в
дадена проба в сравнение с референтен
ген.
Винаги се използват house-keeping гени
(за бета-актин, 18S РНК; GAPDH и др.) с
постоянна, не променлива експресия
като референтна експресия и позитивна
контрола.

RT-PCR – PCR комбиниран с обратна транскрипция
Полимеразно-верижна реакция с една допълнителна стъпка –
синтез на кДНК върху матрица РНК (обратна транскрипция).
Използва се ензим обратна транскриптаза (RT).
Howard Temin, David Baltimore, and Renato
Dulbecco (1970г), открива ензима обратна
транскриптаза и го доказва в
онкогенните вируси. Получават Нобелова
награда 1975 за Медицина
RT е ензим на ретровирусите, които
са РНК-ови вируси, напромер
Human immunodeficiency virus (HIV),
human T cell leukemia virus (HTLV).

Три основни подхода в реакцията обратна транскрипция в
зависимост от избор на подходящи праймери :
Какъв подход ще изберете зависи от крайната цел.
За да имате банка от кДНК на различни иРНК, какви
праймери бихте предпочели?

RT-PCR
PCR продуктите се идентифицират
чрез агарозна електрофореза.
RT-PCR също е полу-количествен
метод, както Northern blot и се
използват праймери и за
амплификация на house-keeping ген.

RT-PCR – се използва за доказване на вирусна
инфекция
Например HCV е РНК-ов вирус, който причинява чернодробно
възпаление. Познати са две форми на вирусния хепатит С – остра и
хронична, която често протича безсимптомно.
Анти-HCV Ab доказват срещата
на пациента с HCV.
Експресията на HCV се доказва
чрез молекулярно-биологични
методи, например RT-PCR.
Серологичните анализи доказват
анти-HCV антитела в серума на
~80% от пациентите 15 седмици
след инфекцията, ~90% - 5 месец;
~97% -6 месец.

За доказване на HCV се изолира вирусна РНК от серум/плазма на
пациенти и се амплифицират фрагменти от неговия геном с праймери
комплементарни на силно консервативни области.
Силно консервативна област от HCV генома е белтък некодиращи
последователности от 5’ област.
На старт от 1 до 5 са проби на пациенти; старт 6 е негативна
контрола; старт 7 позитивна контрола (260 bp); старт 8- маркер.

Според вас има ли сред пациентите експресия на HCV?

•RT-PCR се използва за
диагностика на много други
вируси, като денга вирус,
инфлуенца вирус, Zika вирус и
др.
Eurosurveillance, Volume 13, Issue 30, 24 July 2008
Отговорът към терапия с алфа
интерферон или комбинацията от алфа
интерферон и рибавирин при пациенти с
инфекция с HCV генотип 2 и 3 е почти 3-
пъти по-ефективен от този при генотип 1
•RT-PCR се използва и за
генотипиране на вирусния геном
•Напр. Генотипът на HCV подпомага
терапевтичния подход
•Познати са 6 различни генотипа с
множество подтипове
•

Real-time PCR дава възможност за
широк кръг от анализи:
Идентификация на ДНК/РНК – доказване на вирусни, бактериални
инфекции, генно-модифицирани организми (GMOs);
Генотипизиране- за типизиране на бактериални и вирусни щамове;
анализ на хромозомни мутации,
 SNP анализи – за анализ на едно-нуклеотидни полиморфизми, точкови
мутации
Ниво на генна експресия
количествено определяне на вирусен/бактериален товар,
отчитане разликата между норма и патология,
мониторинг на ефекта от приложена терапия
Експресия на туморни маркери, сигнални молекули, цитокинови гени и
др. за изясняване на молекулните механизми на патологичните
процеси
Качествени анализи
Количествени анализи

PCR в реално време – real time PCR – за
оценка на генната експресия
Примерна схема на real-time PCR

PCR в реално време – real time PCR vs. PCR
За разлика от класическия PCR, при който отчитаме
резултат в края, в реакционното плато на амплификация,
при Real time-PCR отчитаме резултат в експоненциалната
/растящата/ фаза.
Класически PCR

Кой резултат от двата използвани метода /Real Time-PCR и
RT-PCR/ представя по-реална картина на генна експресия?
PCR в реално време – real time PCR
В експоненциалната фаза на PCR чувствителността на
реакцията е най-висока.

При Real time-PCR се отчита сайт-специфичен флуоресцентен
сигнал. Разработени са няколко детекционни системи:
Real time PCR – химия

SYBR Green-интрекалиращо се
флуоресцентно багрило.
• Специфичността на реакцията се определя от праймерите.
• SYBR Green се интеркалира във всяка една двойноверижна ДНК-
включително неспецифични PCR- продукти, димери от праймери
• Не може да се използва за детекция на различни алели/гени

TaqMan -Real time PCR – химия
TaqMan- използват се ген-
специфични праймери и ген-
специфична сонда -
олигонуклеотид специфичен на
вътрешна част на фрагмента
свързан с флуоресцентен
маркер (R) и “гасител” (Q).
Taq полимеразата освобождава
маркера от “гасителя” чрез 5’-3’
нуклеазната си активност.
Флуоресцентния сигнал
нараства пропорционално с
броя на амплифицираните
специфични фрагменти.

TaqMan “изяжда” ген-
специфичната сонда и
разделя физически
флуоресцентния маркер от
гасителя
Нещо любопитно...
TaqMan детекционна система
е наречена така по аналогия с
Pac-Man видео игра.
Pac-Man “изяжда” точките в
лабиринта

Real time PCR – резултат от TaqMan анализ
EXAMPLE GRAPHIC
Ct Ct Ct Ct
threshold
baseline
Отчита се при кой цикъл започва да нараства специфичния
флуоресцентен сигнал, т.нар Цикъл на прагова флуоресценция - Ct

Чрез Real - Time PCR (TaqMan), количествения анализ на генна
експресия може да е в абсолютни стойности (брой копия) или в
отношение към даден калибратор - относителен анализ.
Real time PCR – резултат от TaqMan анализ
При абсолютен анализ
на генна експресия се
използва стандартна
права от проби с
известен брой копия на
интересуващия ни ген.
По стандартната права
се определя точния
брой копия в
изследваната проба.

Какво да направим за да установим
количеството на HBV в точен брой копия?
1) избираме праймери/сонда
комплементарни за ген-S HBV
геном
2) изолираме вирусна ДНК от серум на
пациента
3) амплифицираме чрез Real-time PCR
изолираната от нас проба вирусна ДНК
на пациента и стандарти -проби в които
знаем точния брой копия на гена-S
4) Отчитаме резултата
Как ще интерпретирате
получения резултат?

При относителен/сравнителен количествен анализ чрез Real - Time
PCR, се използва калибратор (нормална тъкан, не третирани клетки;
здрави донори и т.н.) и ендогенна контрола (house-keeping gene).
Real time PCR – резултат от TaqMan анализ
Относителното количество на
генна експресия (Relative
Quantity- RQ) се представя
като пъти повишена/намалена
в сравнение с калибратора
tu 18S
Здрава тъкан
Туморна тъкан
ctrl 18S
За генната
експресия на
гена-Х в
туморна тъкан,
калибратор –
здрава тъкан
ендогенна
контрола – 18S
рРНК, бета-
актин или др.