Същност на ДНК анализа чрез PCR и Видове методи за доказване на полиморфизми

Същност на ДНК анализа чрез PCR и Видове методи
за доказване на полиморфизми по нуклеотидната
последователност на ДНК; PCR и RT-PCR за
диагностика на вируси, бактерии и паразити.

Specific Enzymatic Amplification of DNA
In Vitro: The Polymerase Chain Reaction
K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G.
Horn, and H. Erlich; 1986

GeneAmp 9700
Тип блок-алуминиев,
взаимозаменяемост
96 проби за 0,2ml епрув./плаки
2x384 проби, за 0.02 ml плаки
Температуна област: 4.0°С – 99.9
°С, Peltier система
Нагряващ се капак
Автоматичен “Hot start”
Допълнителни настройки
Висока специфичност
Голяма чувствителност
Бързина
Лесна за автоматизиране
Широка област на
приложение
Апарат за PCR- Polymerase Chain Reaction-
полимеразно верижна реакция
PCR е техника отличаваща се с:

Термична денатурация (denaturation) на двойно-
верижната ДНК при 94С до пълно разделяне на
веригите
Хибридизация (annealing) между праймерите и
комплементарните им секвенции от матричната ДНК.
Температурата на това взаимодействие е строго
специфична и зависи от базовия състав и дължината
на праймерите. Т = 2˚ С (n A/T) + 4˚ С (n G/C)
Синтез в посока 53 (extension) на ДНК веригата
комплементарна на матрицата. Температурата на този
етап се определя от използвания ензим така, че да му
се осигури най-висока ДНК-полимеразна активност.
(За Taq DNA Polymerase тя е 72C).
PCR представлява многократно повтаряне на серия от
цикли, всеки от които включва три стъпки:

Полимеразно-
верижна реакция
Върху едноверижна
ДНК матрица ензима
ДНК-полимераза в
присъствието на
синтетични
олигонуклеотиди
(primers) и четирите
дезокситринуклеотиди
(АТФ, ГТФ, ТТФ,
ЦТФ) синтезира
множество копия от
матрицата -ампликон.

Кинетика на PCR-реакцията

Определяне на патогенен и непатогенен щам от
E. coli чрез PCR на щамово-специфични гени

Апробиране на PCR методика за доказване на
ентеропатогенните щамове (ЕPEC) E. coli
при месо и месни продукти (E. coli O26 и О111)
Амплификация на
фрагмент от гена eae
(482нд), тъй като този
ген се намира само в
патогенните щамове
(ЕРЕС) и отговаря за
експресията на белтъка
интимин, чрез който
патогенният щам се
адхерира по чревната
лигавица.
Eae праймери:
F - 5`-TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT-3’
R – 5’ -GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG -3’

Мултиплексен PCR за Доказване на EHEC
чрез гените за веротоксини - Stx1; Stx2

Multiplex PCR
trials
Element Initial
conc.
End
conc.
DNA 1 µl
10x
buffer
10x 1x
MgCl
2 25 mM 1.5 mM
dNTPs 2 mM
mix
0.2 mM
Primer
pair
50 µM 0.25 µM
Primer
pair
50 µM 0.25 µM
Taq
polym.
5 U/ml 1 U
H
2O Up to 20
µl
Multiplex PCR protokol

Detection of P. larvae strains by multiplex PCR with primers 1-
2/3-4 (Specificity of the method)

Методът на флуоресцентно белязани праймери се
използва за едновременно определяне на няколко SNPs
– мултиплексен PCR

Полиморфизъм I/D на Alu-елемент в 16-ти екзон
на АСЕ ген (ангиотензин-конвертиращия ензим)
Инсерция/делеция на Alu –с 287 bp в 16-ти екзон

Анализ на конформациите на едноверижни нуклеинови
киселини
Single-Stranded Conformational Polymorphysm (SSCP)
ДНК фрагмент се намножава чрез полимеразно-верижна
реакция (PCR)
Денатурация на двуверижната ДНК. PCR-продуктите при
ренатурация придобиват различна конформация
Електрофоретично разделяне на едноверижни фрагменти
ДНК в зависимост от конформацията им.
При една нуклеотидна замяна в даден фрагмент
конформацията му се променя.
Не може точно да се каже каква нуклеотидна
замяна/мутация е настъпила в ДНК фрагмента.
SSCP анализът е подходящ за фрагменти с големина до
350нд

Рестрикционни карти
Ампликона се разкъсва от
специфични ендонуклеази,
нар.рестиктази на различни
по дължина фрагменти.
Два типа рестиктази в
зависимост от начина на
късане:
1. получават се
фрагменти с тъпи крайща
(Hpa I).
2. получават се
фрагменти с лепливи
карайща (Eco RI, Hind III);

Чрез комбинация от няколко рестриктази се получава набор от
фрагменти, които чрез електрофореза се разделят в зависимост
от дължината си.
Разликата в рестрикционните карти на два индивида от един вид
се означава като полиморфизъм по дължината на
рестрикционните фрагменти (restriction fragment length
polymorphism – RLFP). Този метод се използва за определяне на
бащинство и детекция на мутация.

Полиморфизъм по дължината на рестрикционните
фрагменти - Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP)
Дава възможност да
се определи точно
настъпилата промяна
на нуклеотидната
последователност.
детекция на SNP;
детекция на мутации
Електрофореза на
амплификационни
фрагменти след
рестрикция с Taq1 за
определяне на 3’UTR A/C
IL-12 полиморфизма

The amplification refractory mutation system PCR
or allele specific PCR (ARMS-PCR) – алел
специфична амплификация
Електрофореза след
ARMS-PCR за IL-6 -174
А/G полиморфизъм.

Апробирани методи за
генотипизиране в лаб. по
Молекулярна биология на МФ :
Полиморфизъм по дължината
на рестрикционните фрагменти
(RFLP)- след PCR реакция
продуктите се обработват с
рестриктази: напр.TaqI при
определяне 3'UTR А/С на IL-
12B гена
Алел специфичeн PCR
(ARMS-PCR) при
определяне на IL-10 -
1082 A/G
полиморфизъм.
Изолиране на ДНК от периферна кръв; тъкани и слюнка

Генотипизиране на хепатитния вирус В (HBV-
осем генотипа A до H) чрез PCR-RFLP с две
рестриктази: А-ЕcoR1 и B- BamH1
А:1- HBV генотип G
2- HBV генотип А
3- G и А едновременно и
lamivudine резистентен
B:1- HBV генотип G
2- HBV генотип B
3- HBV С(най-агресивен)
4- HBV генотип B,C и G,
lamivudine резистентен
Лечение: интерферон
алфа и нуклеотидни
аналози- еntecavir,
tenofovir; lamivudine

Генотипизиране на хепатитния вирус C -HCV
Генотип-зависима
терапия с INF-alpha
(pegasys)+ribavirin:
1 и 4 генотип- min12
месеца; ефективност 42-
46%
2 и 3 генотип – min 6
месеца с ефективност
72-80%

Идентификация и генотипизиране на папилома
вирус - HPV
идентификация на вирусна
ДНК от HPV генотипи 16 и
18. Teзи два генотипа се
откриват при 78% от
случаите на цервикален
адено карцином от общо 22
генотипа на HPV вируса .
В Европа –годишно 50 000
новозаразени от които 25
000 умират
У нас 1000 от които 350
умират
HPV, като основен причинител
на цервикален рак е открит
от Харалд цур Хаузен - 1983.
Два гена –Е6 и Е7 постоянно се
транскрибират в туморните
клетки

Идентификация на криптоспоридии и
генотипизиране на ламблия чрез PCR
Електрофореза след
PCR за идентификация
на C. parvum от
фекални проби .
Електрофореза след
PCR за генотипизиране
на А и В Lamblia
intestinalis от фекални
проби .

Генотипизиране на говежди и човешки
криптоспоридии чрез мултиплексен PCR
1,2,9,10 и 11 – говежди
3,4,5,7 и 8 - човешки

Хибридизационн
и методи
Northern Blot
1.Изолираната иРНК или обща РНК се
разделя в зависимост от
молекулното тегло чрез агарозна
електрофореза.
2.Разделените РНК молекули се
прехвърлят върху нитроцелулозна
мембрана.
3.Идентифициране на интересуващата
ни РНК чрез белязана с
32
P
специфична ДНК сонда.
4.Полуколичествен метод

Northern
Blot
PEDF- Pigment
epithelium-
derived factor
Изключително
силен анти-
ангиогенезен
фактор, чиято
функция се
регулира от
количеството
кислород
Понижена или
липсата на
експресия на
PEDF е
асоциирана с рак
на простата