МИКРОБИОЛОГИЯ Практически изпит

МИКРОБИОЛОГИЯ
Практически
изпит

Конспект:

1. Микроскопски методи на оцветяване на микроорганизмите - наблюдение и интерпретиране
2. Обикновени хранителни среди - видове, състав, приложение. Описание на културелните
свойства при растеж на течни и твърди хранителни среди.
3. Специални хранителни среди - видове, състав, приложение. Описание на културелните
свойства при растеж на течни и твърди хранителни среди.
4. Елективни, селективни и диференциращи среди - видове, състав, приложение. Описание на
културелните свойства при растеж на течни и твърди хранителни среди.
5. Анаеробно култивиране - методи. Култивиране при повишена концентрация на СО2.
6. Политропна среда на Клиглер - състав, начин на посяване, отчитане, приложение.
7. Определяне чувствителността на бактериите in vitro към антибиотици и химиотерапевтици
чрез метода на серийните разреждания (определяне на минимална инхибираща
концентрация).
8. Определяне чувствителността на бактериите in vitro към антибиотици и химиотерапевтици
чрез дифузионния метод на Бауер - Кърби.
9. Реакция аглутинация тип Грубер - принцип, извършване, отчитане, интерпретиране на
резултатите.
10. Реакция аглутинация тип Видал - принцип, извършване, отчитане, интерпретиране на
резултатите.
11. Коаглутинация, латекс- аглутинация, хемаглутинация - принцип, отчитане и
интерпретиране на резултатите.
12. Пръстенна преципитация по Асколи - принцип, извършване, отчитане и интерпретиране.
13. Преципитация в агаров гел - принцип, извършване, отчитане и интерпретиране.
14. АST реакция (определяне на антистрептолизинов титър) - принцип, отчитане и
интерпретиране на резултатите.
15. Реакция свързване на комплемента ( РСК) - принцип, отчитане и интерпретиране на
реакцията на Васерман.
16. Реакция ELISA - принцип, отчитане, интерпретиране. Имунофлуоресценция - пряк и
непряк метод, приложение.
17. Имунни реакции с белязани антигени или антитела.
18. Реакция вирусна хемаглутинация - принцип, отчитане, интерпретиране на резултатите.
19. Реакция задръжка на вирусната хемаглутинация - принцип, отчитане, интерпретиране на
резултатите.
20. Вируснеутрализираща реакция - принцип, отчитане, интерпретиране



Ерсин Исмаил

Тема № 1: „Микроскопски методи на оцветяване
на микроорганизмите - наблюдение и интерпретиране.”

За изучаване на морфологията и структурата на бактериалната клетка се използва
микроскопският метод. Той позволява да бъдат наблюдавани както живи, така и убити
бактерии в неоцветено или оцветено състояние.
Наблюдение в неоцветено състояние. Бактериите са живи, може да се наблюдава
тяхната подвижност, размножаване и пр. Методи  какво се вижда:
 Свеж покривен препарат – неоцветени, блестящи бактерии, преминаващи бързо през
зрителното поле (при частично спуснат кондензор);
 Мокър тушов препарат – изисква се фазово-контрастен микроскоп, отличен метод за
наблюдение на капсули – виждат се като светли ореоли около тъмните бактерии;
 Тушов препарат по Бури – наблюдава се с имерсия, тушът не оцветява бактериалната
клетка и микроорганизмите се виждат неоцветени, блестящи на тъмен фон.
За да се наблюдават бактериите в оцветено състояние, трябва да се направи
микроскопски препарат. За тази цел е необходимо: 1. Приготвяне на натривка; 2. Изсушаване;
3. Фиксиране; 4. Оцветяване.
Прости методи за оцветяване. За изучаване на форма и големина на клетката, без
структурните елементи. Използва се за гонококи, менингококи и др. Методи:
 Оцветяване с метиленово синьо по Льофлер – микробите се сини;
 Оцветяване с разреден функсин на Пфайфер – микробите са червени.
Сложни методи за оцветяване. Използват се за диференциране на различни видове
бактерии при микробиологичната диагноза на инфекциозните заболявания. Методи:
 Оцветяване по Грам: реактиви – карбол-генцианвиолет, Луголов разтвор, етанол и
разреден фуксин. Отнасянето на бактериите по Грам се определя от тяхната
способност да задържат образувалия се комплекс генцианвиолет-луголов разтвор.
Грам-положителните са СИНИ, а грам-отрицателните – ЧЕРВЕНИ.
Забележка: в стари култури Грам(+) могат да изглеждат като Грам(-);
 Оцветяване по Найсер: използва се за доказване на волутинови включения, които се
съдържат в някои патогени (дифтерийния бактерий) и сапрофити (млечнокисели
бактерии). Използват се 2 разтвора – Найсер-1 и Найсер-2. Волутиновите включения
имат по-силен афинитет към алкалните бои, затова остават оцветени в синьо-виолетово
на фона на кафявата клетка;
 Оцветяване по Цил-Нилсен: за киселинноустойчиви бактерии – такива, които не се
обезцветяват под действието на концентрирани киселини. Бактериите са оцветяват в
червено, а останалите клетъчни компоненти в синьо;
 Оцветявания за спори: по Мьолер (спорите са червени, вегетативната клетка синя) и
по Пешков (спорите са сини, вегетативната клетка - червена);
 Оцветяване на капсули: Гинс, Клет, Хис, Бури. По Клет – капсулата е червена, а
бактериалната клетка – синя.

Тема № 2: „Обикновени хранителни среди - видове, състав,
приложение. Описание на културелните свойства при растеж
на течни и твърди хранителни среди.”

Обикновените хранителни среди се използват за култивиране на повечето от
бактериите и служат като основа в приготвянето на сложните хранителни среди.
Видове: месна вода (сварено телешко месо, което се филтрира и стерилизира), месно-
пептонен бульон (МПБ) – местна вода + 1% пептон, 0,5% NaCl; месно-пептонен агар (МПА)
– МБП + 2-4% агар; месно-пептонен желатин (МПЖ) – МПБ + 10-20% желатин. Използват
се още пептонна вода и трипсинов бульон по Хотингер.
По своята консистенция хранителните среди биват – течни, полутвърди, твърди и
прахообразни. Течните се използват за проучване на физиологичните и биохимични
особености на бактериите. Служат за натрупване на биомаса и продукти от обмяната на
веществата.
Твърдите хранителни среди се приготвят от течните като се прибавят втвърдяващи
вещества. Използват се за изолиране на бактерии в чиста култура, проучване морфологията на
колониите, изследване на антибиотичната чувствителност на бактериите. Втвърдителите имат
някои особености, влияещи на бактериалния растеж:
 Агар-агар: придава плътност и еластичност на средата, без да променя хранителните
качества; могат да се стерилизират няколко пъти;
 Желатин: екстракт с белтъчен състав, богат на колаген. Втечнява се при температура,
по-ниска от оптималната за живот на бактериите, което ограничава неговото
приложение като уплътнител;
 Силикагел: най-вече за синтетични среди със строго определен състав. Няма
температура на топене и втвърдяване, липсва концентрация на ползване. Петриевите
панички със силикагелните пластинки се съхраняват под вода преди употреба.


Тема № 3: „Специални хранителни среди - видове, състав,
приложение. Описание на културелните свойства при растеж
на течни и твърди хранителни среди.” = Тема № 4

Сложните (специални) хранителни среди се получават от простите при добавяне на
различни субстрати, благоприятстващи растежа и размножаването на бактериите. Разделят се
на елективни (избирателни), селективни, диференциращи и за анаеробно култивиране.
Елективните среди се използват за култивиране на бактерии, които не могат или
слабо се развиват в обикновените хранителни среди. Тук се отнасят: серумен бульон, асцитен
бульон, серумен и асцитен агар, глюкозен бульон, глюкозен агар, кръвен агар, шоколадов
агар, коагулиран серум по Льофлер, картофено-глицерино-кръвен агар на Борде-Жангу, среда
на Тароци и др. Особености на по-често използваните:
 Кръвен агар: получава се като към МПА се прибави 5% прясна, дефибринирана кръв
(овнешка, заешка и др.). Използва се за култивиране на взискателни бактерии и за
изпитване на хемолитична активност на бактериите;
 Шоколадов агар: вариант на кръвен агар, загрят на водна баня до получаване на
шоколадов цвят. Кръвните белтъци стават по-лесно усвоими за някои патогенни
бактерии – гонококи, менингококи, пневмококи и др.;
 Агар на Борде-Жангу: за култивиране на коклюшни бактерии (B. pertussis);

 Среда на Тароци: говежди черен дроб, сварен в МПБ, филтриран. Черният дроб има
редуциращи свойства по отношения на кислорода – създават се условия за анаеробно
култивиране.
Селективните хранителни среди се използват за култивиране на определени
бактерии, като растежът и размножаването на всички други се потиска от прибавени към
средата вещества. Биват:
1. Течни - за натрупване на бактерии, ако те са в недостатъчно количество в изследвания
материал: среда на Кауфман + среда на Рапопорт (салмонели), Среда на Мьолер (тиф,
паратиф), селенитов бульон (дизентерийни, салмонели), пептонна вода (холерни вибриони).
2. Твърди - за изолиране на чисти култури: среда на Петраняни + среда на Льовенщайн-
Йенсен (туберкулозни бактерии), апохолат-цитрат агар (АЦА) + БГФРА (за Е. coli), SS-агар –
салмонела-шигела агар.
Диференциращите (индикаторни) среди дават възможност да се диференцират
отделните видове бактерии по някакъв биохимичен белег. Бактериите се различават по своята
биохимична активност и имат различен набор от ензими, разграждащи веществата в
хранителните среди. Те съдържат:
1) Основна хранителна среда, обезпечаваща размножаването на бактериите;
2) Определен субстрат, различното отношение към който е диагностичен белег (пр. лактоза);
3) Индикатор, чийто променен цвят показва, че е протекла реакция
В практиката този вид среди се използват с 2 основни цели:
 Диференциране: разлагащи/неразлагащи лактозата чревни бактерии – Ендо, Левин,
Гаснер. Около колониите на лактозо-положителните се образува червен ореол, а при
лактозо-отрицателните нямаме промяна на цвета;
 Идентификация: чрез тях се проучват изолираните чисти култури, като се изучава
биохимичната активност на бактериите – доказват се захаролитични, протеолитични и
окислително-редукционни свойства. Тук се отнасят пъстрата редица на Хис, както и
политропната среда на Клиглер, която проследява 5 белега: разграждане на лактоза и
глюкоза, образуване на газ и сероводород, наличие на уреаза.
Среди за анаеробно култивиране: мозъчно-сърдечна, на Тароци, у нас – на Цайслер,
Комкова, Розенов, VL и др.


Тема № 5: „Анаеробно култивиране - методи. Култивиране
при повишена концентрация на СО2.”

Анаероби са всички видове бактерии, които не могат да се развиват при наличие на
кислород. Създаването на безкислородната среда се постига с помощна на различни методи:
1. Физични методи:
 Анаеростати: метални съдове, които се затварят херметично, а въздухът се изтегля. В
практиката най-често се използва микроанаеростатът на Кнор. Епруветките или
петриевите панички се нареждат с капаците нагоре, въздухът се евакуира и апаратът се
поставя в термостат за култивиране при оптимална температура за 24-48 часа. Като
анаеростати могат да се използват и обикновените вакуумни ексикатори;
 Култивиране в атмосфера с индиферентен газ: след изтегляне на въздуха се вкарва
азот, водород или хелий + катализатор;
 Апаратни системи за анаеробно култивиране: много видове, един принцип на действие
– под действие на катализатор, отделеният в съда водород се свързва с кислорода като
се образува вода. Примери: GasPak, GasKit. Индикаторите могат да бъдат както

химични, така и биологични – напр. P.aeruginosa за отрицателен индикатор (облигатен
аероб) и положителен индикатор – Clostridium sporogenes.
2. Химични методи: използва се свойството на пиригалола в алкална среда да свързва големи
количества кислород. Не се изисква специална апаратура.
3. Микробиологичен метод. Пример е методът на Фортнер, който се основава на съвместно
култивиране на аеробни и анаеробни бактерии, при което аеробните изразходват кислорода.
На твърда хранителна среда се прави разрез през средата. В едната половина се посява аероб,
в другата – анаероб, след което петрито се херметизира. При метаболизма си, аеробния вид
отделя CO2, като го увеличава в атмосферата, благоприятен фактор за анаероба.
Култивиране при повишена концентрация